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文档简介

1、 简并引物：简并引物：是克隆未知基因的一种引物设计方案。简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平设计引物。由于大多数氨基酸的遗传密码不止一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。 利用利用NCBI搜索不同物种中同一目的基搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列编码的氨基酸序列。 因为不同物种的密码子偏好问题，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，

2、所以氨基酸序列才是真正保守的。 对所找到的序列进行多序列比对对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对 确定合适的保守区域确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50400个氨基酸为宜，使得PCR产物在1501200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸。 利用软件设计引物利用软件设计引物Primer 5.0 支持简并引物的设计在线设计：CODEHOP GeneFisher2 对引物的修饰对引物的修饰降低简并度的方法：通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基通过密码子偏好选择合适的碱基 利用软件设计引物利用软件设计引物Primer 5.0 支持简并引物的设计在线设计：CODEHOP GeneFisher2 对引物的修饰对引物的修饰降低简并度的方法：通过密码子偏好选择合适的碱基通过用次黄嘌呤代替简并度高的碱基 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如甲硫氨酸和色氨酸均只有一个密码子。尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3末端

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