实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(4)

1、实验五实验五DNADNA限制性酶切和限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶限制性内切酶EcoR I Restriction Enzyme识别序列：识别序列： -GAATT C - - C TTAAG -Hind III Restriction Enzyme识别序列：识别序列： - AAGCT T - - T TCGAA - 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：范围：7.58.0 缓冲液组份缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇巯基乙醇 温度：温度：37琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶

2、电泳 是一种简便、快速的分离纯化是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。和鉴定核酸的方法。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。电电 泳泳琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12试试 剂剂TBE电泳缓冲液电泳缓冲液 45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0加样缓冲液加样缓冲液 0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp

3、） 40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）（溴化乙锭）染色液（有毒） 0.5ug /ml，用水配制溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。反应体系反应体系 DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul混匀，混匀，37度保温度保温30分钟分钟 制 胶用电极缓冲液（ 0.5TBE）配制0.7% 的琼脂糖胶20mL0.14g琼

4、脂糖，20mL 0.5TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固点点 样样 Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye 点样：点样： Sample 1和3各7ul Sample 2和4各10ul电电 泳泳接通电源，150v电泳0.5小时染色和观察染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放切断电源，取出胶模，将

5、凝胶放入入EB染色液中，染色染色液中，染色10分钟分钟取出凝胶，紫外灯下观察取出凝胶，紫外灯下观察DNA电电泳带型泳带型警告警告EB诱变诱变染色和观察时一定要带手套！染色和观察时一定要带手套！ 1 2 3 4 RNA提提 示示1 自提自提DNA2 自提自提DNA / Hind III 3 -DNA / Hind III 4 -DNA 结果记录与分析结果记录与分析绘制电泳图谱绘制电泳图谱 -DNA / Hind III Marker-DNA/Hind III Marker 用用Hind III彻底降解彻底降解-DNA贮藏缓冲液：贮藏缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 10mol/L NaCl, 1mol/L EDTA-DNA