第四章基因克隆的载体其他载体

1、第五节第五节 其他载体其他载体其他载体其他载体一、酵母细胞中克隆基因常用载体一、酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （YACYAC） 二、植物基因克隆的载体二、植物基因克隆的载体TiTi质粒质粒 三、动物基因克隆的载体三、动物基因克隆的载体病毒病毒 四、哺乳动物人工染色体四、哺乳动物人工染色体一、酵母细胞中克隆基因常用载体一、酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 (YAC)(YAC)1、简介：、简介：yeast artificial chromosome, YAC:是在酵母细胞中克隆大片段外源是在酵母细胞中克隆大片段外源DNA的克隆载体

2、。的克隆载体。可以随酵母细胞分裂周期复制繁殖。可以随酵母细胞分裂周期复制繁殖。质粒、噬菌体等：外源基因，一般不超过质粒、噬菌体等：外源基因，一般不超过50 kb；YAC: 外源基因，外源基因， 1000 kb，或更多，或更多 2、结构：、结构： YAC以质粒的形式出现，以质粒的形式出现， 长度约长度约11.4 kb. * 四膜虫端粒（四膜虫端粒（Tel)：* 酵母复制起点（酵母复制起点（ARS)：* 酵母着丝粒酵母着丝粒 (CEN)： 酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、URA3)：TRP1：色氨酸合成酶基因：色氨酸合成酶基因URA3：尿嘧啶合成酶基因：尿嘧啶合成酶基因TEL teles

3、ome sequences; ARS autonomous replicating sequence;CEN centromere sequence;Oriorigin of replication for propagation in an E. coli host. 3、功能：、功能：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（Tel)：* 酵母复制起点（酵母复制起点（ARS)：* 酵母着丝粒酵母着丝粒 (CEN)：* 酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、URA3)：确保染色体完整性，并维持其线状确保染色体完整性，并维持其线状结构；结构；复制起始，类似于质粒的复制复制起始，类似于质粒的复制起始点；起

4、始点；细胞分裂时保证染色体能正确进入细胞分裂时保证染色体能正确进入子代细胞；子代细胞；筛选重组子。筛选重组子。TRP1：色氨酸合成酶基因：色氨酸合成酶基因URA3：尿嘧啶合成酶基因：尿嘧啶合成酶基因4、转运、转运外源基因外源基因流程：流程：环状环状DNA 用用BamH 酶切成线状酶切成线状DNA ，再插入外源基因。，再插入外源基因。YAC载体载体正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（Tel)*酵母复制起点（酵母复制起点（ARS)* 酵母着丝粒酵母着丝粒 (CEN)* 酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、URA3) 二、植物基因克隆的载体二、植物基因克

5、隆的载体Ti质粒质粒Tumor inducing plasmid（肿瘤诱导质粒）（肿瘤诱导质粒）1 1、特点、特点 TiTi质粒存在于能够引起植物形成冠瘿质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由瘤的土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由TiTi质粒决定的，故称为肿瘤诱导质粒。质粒决定的，故称为肿瘤诱导质粒。2、Ti质粒质粒DNA组成组成 双链环状双链环状DNA，约，约200 kb，可携带一般真核基因。，可携带一般真核基因。T-DNA，约，约23kb，具有整合到植物染色体，具有整合到植物染色体DNA中中的特性。的特性。另外还有两个功能：另外还有两个功能：*决定植物形成冠瘿瘤；

6、决定植物形成冠瘿瘤；*控制冠瘿碱的合成。控制冠瘿碱的合成。Vir基因：基因：所表达蛋白有利于所表达蛋白有利于整合到植物整合到植物DNA上。上。3、Ti质粒的改造质粒的改造*减小减小DNA长度；长度；*把把T-DNA当中的可诱发冠瘿病的部分替换掉当中的可诱发冠瘿病的部分替换掉或突变使其失去活性。或突变使其失去活性。 三、动物基因克隆的载体三、动物基因克隆的载体病毒病毒猿猴空泡病毒猿猴空泡病毒40（SV40，Simian Vacuolating Virus 40）。）。可把外源基因转入哺乳动物细胞。是呈可把外源基因转入哺乳动物细胞。是呈20面体的动物面体的动物病毒，有蛋白质外壳，所含病毒，有蛋白质

7、外壳，所含DNA 为闭合环状双链为闭合环状双链DNA，5.2 kb，可携带约，可携带约2.5 kb 的外源的外源DNA。改造类型：改造类型：取代型：外源取代型：外源DNA 插入并取代插入并取代SV40 DNA 中中 的一段的一段DNA；病毒病毒-质粒重组型：将病毒基因中维持其在哺乳质粒重组型：将病毒基因中维持其在哺乳 动物中复制的序列分离并和细菌质粒重组动物中复制的序列分离并和细菌质粒重组 后形成的后形成的SV40。 质粒质粒和和噬菌体噬菌体载体只能在载体只能在细菌中繁殖细菌中繁殖，不，不能满足真核能满足真核DNADNA重组需要。感染动物的重组需要。感染动物的病毒病毒可可改造用作改造用作动物细

8、胞动物细胞的载体。由于动物细胞的培的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒猴肾病毒SV40SV40（Simian Virus 40Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多

9、为将目的病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作或作基因治疗基因治疗等。等。 猴病毒猴病毒4040（SV40SV40）的基因组常用来作为克隆的基因组常用来作为克隆载体，把外源载体，把外源DNADNA转入转入哺乳类细胞哺乳类细胞。猴病毒。猴病毒4040是球形动物病毒，直径是球形动物病毒，直径40nm40nm，呈，呈2020面体，有一面体，有一个共价闭环的双链个共价闭环的双链DNADNA基因组，全长基因组，全长5244bp5244bp。它在猴肾中增殖。被它在猴肾中增殖。被SV40SV40感染的细胞都会出现感染的

10、细胞都会出现SV40SV40的的T T抗原。早已证明完整的小鼠染色体抗原。早已证明完整的小鼠染色体珠珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在合在SV40SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠效地处理小鼠珠蛋白的初级转录本。珠蛋白的初级转录本。SV40SV40作为克隆载体有其局限性：作为克隆载体有其局限性：SV40SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源利于外源DNADNA的重组和表

11、达；的重组和表达；早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；有顾虑；重组重组DNADNA片段的大小受体限制。片段的大小受体限制。 逆转录病毒逆转录病毒是是RNARNA病毒病毒，它有三个基因：，它有三个基因：gag-gag-编码病毒的核心蛋白；编码病毒的核心蛋白；polpol- -编码逆转录酶；编码逆转录酶；envenv- -编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（还带有癌基因（voncvonc），即有的逆转录病毒有），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺

12、陷型病毒（病毒（defective virusdefective virus）使逆转录病毒成为有）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。体造血前体细胞，并在细胞中表达。 Hock Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的行包装的信号（一段尚未鉴定的DNADNA顺序）。用这种缺顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞

13、株包含有陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（辅助病毒（helper virushelper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的病毒的RNARNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒病毒外

14、壳蛋白中的逆转录病毒RNARNA，进入骨髓细胞，病，进入骨髓细胞，病毒毒DNADNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被也就无法增殖，而只能被“陷陷”在宿主基因组中，通过在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。细胞分裂而传给下一代子细胞。 人基因组十分庞大，约含人基因组十分庞大，约含4 410109 9bpbp，建立和筛选人的基

15、因组文库，要求有，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YACyeast artificial chromosome,YAC）载体）载体应运而生。应运而生。YACYAC含有酵母染色体端粒（含有酵母染色体端粒（telesometelesome）、着丝点）、着丝点(centromere(centromere) )及复及复制起点等功能序列，可插入长度达制起点等功能序列，可插入长度达200-200-500kb500kb的外源的外源DNADNA，导入酵母细胞可以，导入酵母细胞可以随细胞分裂周

16、期复制繁殖供作克隆，成随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要为人基因组研究计划的重要 四、哺乳动物人工染色体四、哺乳动物人工染色体(MAC)BAC载体载体Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replicatio

17、n and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.PAC载体载体OVer!小小 结结载体的概念、性能载体的概念、性能plasmidplasmid质粒载体质粒载体必须必须具备的基本条件具备的基本条件pUCpUC质粒载体质粒载体pBR322pBR322质粒载体质粒载体phagephage phagecos ends主要类型主要类型包装长度包装长度M13vectorM13vectorRF DNA噬菌粒载体噬菌粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体特点、结构特征、特点、结构特征