课题1《微生物的实验室培养》(上课用)

1、微生物的类群：微生物的类群：真菌真菌原生动物原生动物特点：特点：结构都相当简单结构都相当简单, ,个体多数十分微小个体多数十分微小. .通常要通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构没有细胞结构. .且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素. .不能进行不能进行光合作用光合作用. . 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界原核生物界原核生物界无细胞结构无细胞结构原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞1 1、提供合适的营养和环境条件、提供合适的营养和环境条件2 2、防止杂菌污染、防止杂菌污染一、培养基一、培养基1、概念、概念为微生

2、物生存提供合适的环境和营养物质为微生物生存提供合适的环境和营养物质思考：微生物思考：微生物“吃吃”什么什么？2.2.成分：成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含C C、H H、OO、NN的的有机物有机物是是异异养型微生物的养型微生物的碳源碳源、

3、氮源氮源、能源能源（1 1）基本成分：）基本成分：（2 2）特殊营养物质：）特殊营养物质： 维生素、碱基等维生素、碱基等（3 3）pHpH、氧气的需求：、氧气的需求：3.3.种类种类：（1 1）物理性质划分：）物理性质划分：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂凝固剂- -琼脂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产生长因子生长因子( (即细菌生长必需，而自身不能合成的化即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物合物, ,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) )（2 2）化学成分划分：）化学成分划分：天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基（3 3）

4、用途划分：）用途划分：选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基含化学成分不明确的天然物质培养基成分明确在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要微生物的生长，促进所需的微生物的生长根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品4.4.培养基配制的程序：培养基配制的程序：计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。的细菌基础培养基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼

5、脂琼脂20.0g不同的微生物往不同的微生物往往需要采用不同往需要采用不同的培养基配方的培养基配方 ( (参考教材附录参考教材附录内容内容) )5.5.实例：实例：二、无菌技术二、无菌技术1、概念、概念无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，在培养微生物的操作中，所有所有防止外来杂菌污染的方法。防止外来杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的无论是随后将要学到的倒平板倒平板、平板划线平板划线操操作，还是作，还是平板稀释涂布法平板稀释涂布法，其操作中的每一，其操作中的每一步都需要做到步都需要做到“无菌无菌”，即防止杂菌污染。，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成只有熟练、规范地

6、进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。功地培养微生物。二、无菌技术二、无菌技术2、消毒、消毒（1）定义：）定义：是指使用较为是指使用较为温和的温和的物理或化学方法仅杀物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）生物（不包括芽孢和孢子）二、无菌技术二、无菌技术（2）消毒常用方法：）消毒常用方法： 煮沸消毒法煮沸消毒法:100:100煮沸煮沸5-6min5-6min 巴氏消毒法：巴氏消毒法：707075 75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min 化学药剂消毒法化学药剂消毒法: :用用75%

7、75%酒精进行酒精进行皮肤消毒皮肤消毒; ;用氯气消毒水源等；适量用氯气消毒水源等；适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液等喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液等 紫外线消毒紫外线消毒二、无菌技术二、无菌技术3、灭菌、灭菌（1）定义：）定义：是指使用是指使用强烈的强烈的理化因素杀死物体内外所理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。有的微生物，包括芽孢和孢子。二、无菌技术二、无菌技术（2）灭菌常用方法：）灭菌常用方法：灭菌方法灭菌方法适用对象适用对象所需条件所需条件灭菌时间灭菌时间灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌接种的金属工具、接种的金属工具、试管口、瓶口试管口、瓶口耐高

8、温、需保持耐高温、需保持干燥的物品如玻干燥的物品如玻璃器皿和金属用璃器皿和金属用具具培养基、实验器培养基、实验器具等具等在酒精灯的火焰在酒精灯的火焰燃烧层充分灼烧燃烧层充分灼烧干热灭菌箱内，干热灭菌箱内，160-170100KPa、121 直至烧红直至烧红12h1530min干热灭菌箱干热灭菌箱二、无菌技术二、无菌技术高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台二、无菌技术二、无菌技术4、无菌范围、无菌范围1. 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养

9、物被其无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3 3）需要消毒。）需要消毒。单个

10、单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1. 1.定义：定义：鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体三、菌落三、菌落（肉眼可见）（肉眼可见）1 1、器具的灭菌、器具的灭菌2 2、培养基的配制、培养基的配制3 3、培养基的灭菌、培养基的灭菌4 4、倒平板、倒平板5 5、微生物接种、微生物接种6 6、恒温箱中培养、恒温箱中培养7 7、菌种的保存、菌种的保存四、微生物实验室培四、微生物实验室培养的基本操作程序养的基本操作程序1000ml1000ml

11、牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1. 1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封

12、口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养约约5050五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养1. 1.将灭过菌的培养皿放将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉锥形瓶，左手拨出棉塞。塞。约约5050灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养2.2.右手拿锥形瓶，右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过使瓶口迅速通过火焰。火焰。约约5050五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆

13、菌的纯化培养3.3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基的培养基( (约约1020mL)1020mL)倒入培养皿，左倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。手立即盖上培养皿的皿盖。约约5050五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养防止皿盖上的水防止皿盖上的水珠落入培养基，珠落入培养基，造成污染造成污染4.4.等待平板冷却凝固，大约等待平板冷却凝固，大约需需510min510min。然后，将平板。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。皿底在上。 1. 1.培

14、养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？基的温度？答答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。以进行倒平板了。问题讨论问题讨论 2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。染培养基。问题讨论问题讨论3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板

15、冷凝后，为什么要将平板倒置？答答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。养基，造成污染。问题讨论问题讨论 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？还能用来培养微生物吗？为什么？答答：空气中的微生物可能在

16、皿盖与皿底：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。这个平板培养微生物。问题讨论问题讨论五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌1、原理、原理在培养基上将细菌稀释或分散成单个细在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落是一个纯化的细菌菌落2、接种方法、接种方法平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法操作简单，单菌落不易分离，不适用对微生物进行计数操作复杂，单菌落易分离，也适用于对微生物进行计

17、数概念概念菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养-平板划线法平板划线法（2 2）具体操作）具体操作是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面1. 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什

18、么？灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死得到菌落。划线结束后灼烧接种环

19、，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。操作者。 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。细菌繁殖而来的菌落。五、大肠杆菌的纯化培养五、大肠杆菌的纯化培养-稀释涂布平