病原生物学实验

1、实验一 （5学时）一、实验室生物安全一、实验室生物安全 熟悉熟悉 （1 1）微生物学实验室生物安全意义）微生物学实验室生物安全意义 （2 2）实验室规则）实验室规则 2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。 2010年12月，东北农业大学28名师生在“羊活体解剖学实验课”中感染布鲁氏菌病。2011年6月，东北农业大学免去该校动物医学院院长和党支书职务。感染病菌的学生称，羊没有被检疫，被染病的羊那天被几个班级的学生重复使用。 感染的主要原因是：感染的主要原因是： 防护意识不强；防护意

2、识不强； 操作失误，防护条件不足。操作失误，防护条件不足。P4P4实验室实验室P2P2实验室实验室P1P1实验室实验室操作在通常情况下不会引起人类或操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物者动物疾病的微生物操作能够引起人类或者动物疾病，但一般操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危情况下对人、动物或者环境不构成严重危害害操作能够引起人类或者动物严重疾病，操作能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物与人、动物与动物间传播的微生物操作能够引起人类或者动物非常严重操作能够引

3、起人类或者动物非常严重疾病的微生物，尚无有效预防或治疗疾病的微生物，尚无有效预防或治疗方法方法P3实验室实验室病原生物学实验室规则病原生物学实验室规则 学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。折，要经常清洗消毒。 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。定的储物柜内。 严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避

4、免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 实验过程中避免一切不良的个人习惯；实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料操作中产生的废料要扔在指定容器内要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。实验室意外紧急处理办法实验室意外紧急处理办法1 1 皮肤破损皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%2%碘酊或碘酊或2%2%红汞红汞涂抹。涂抹。2 2 烧伤：局部涂凡士林，烧伤：局部涂凡士

5、林，2%2%鞣酸或鞣酸或2%2%苦味酸。苦味酸。3 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%2%硼酸洗涤中和硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1 12 2滴滴眼）。滴滴眼）。4 4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，菌液入口：立即吐入消毒容器内，1 1：10001000高锰酸钾或高锰酸钾或3%3%双氧水双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。漱口，根据菌种服用抗菌药物。5 5 菌液污染台面菌液

6、污染台面：2%3% %来苏尔或来苏尔或0.1%0.1%新洁尔灭覆盖新洁尔灭覆盖3030分钟后抹分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3 3分后肥皂和清水洗净。分后肥皂和清水洗净。6 6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。二、无菌操作技术二、无菌操作技术实验目的 1 1 掌握常用的细菌接种方法 2 2 熟悉细菌生长现象的观察方法 （一）细菌的分离培养和接种技术（一）细菌的分离培养和接种技术接种工具

7、接种针和接种环 L型玻璃棒接种环境 接种罩、超净工作台或无菌室内进行。接种方法接种方法1.平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。分区划线分区划线 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂. 第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5. 划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复. 每次划完后应灭菌.连续划线法连续划线法2.斜面接种法： 用于菌种移种，以进一步鉴定 和保存菌种。 3.3.半

8、固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。4.4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基 的接种。 将上述已接种细菌的培养基置37恒温培养箱中孵育1824h，观察细菌的生长现象。（二）细菌在培养基上的生长现（二）细菌在培养基上的生长现象象1.细菌在细菌在固体固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象 菌落菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。 菌苔菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物物。菌落与菌苔菌落与菌苔菌落菌苔2.细菌在细

9、菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象 混浊：大多数细菌 沉淀：多见于链状排列的细菌。 菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌） 。细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌沉淀均匀浑浊对照3.细菌在细菌在半固体半固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象 有鞭毛细菌： 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌： 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长细菌在半固体培养基中的生长现象现象有动力 现象无动力 现象三、细菌的形态学检查三、细菌的形态学检查形态学检查分类 一、不染色标本检查( (活体） 悬滴法 压滴法 二、染色标

10、本检查 单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色） 复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色） 革兰染色(Gram stain)(Gram stain) 1884 1884年由丹麦医师GramGram创立 革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义. .目的：目的：1 1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法2 2、熟悉革兰染色的原理和临床意义、熟悉革兰染色的原理和临床意义1 1、通透性学说、通透性学说2 2、等电点学说、等电点学说3 3、化学学说、化学学说原理：原理： 通透性学说通透性

11、学说G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易脱除染料。G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易脱除染料。 等电点学说等电点学说G+菌等电点（pI23）G-菌等电点（pI45） 在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。化学学说化学学说G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐核糖核酸镁盐很少，故易被脱色 器材和试剂：器材和试剂： 1 1、菌种、菌种 金黄色色葡萄球菌金黄色色葡萄球菌 大肠杆菌大肠杆菌 2 2、试

12、剂、试剂 革兰染色液革兰染色液 初染液初染液 结晶紫结晶紫 媒染液媒染液 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 脱色液脱色液 95%95%乙醇乙醇 复染液复染液 稀释石碳酸复红稀释石碳酸复红 3 3、其它、其它 接种环接种环 载玻片载玻片 染色盘染色盘 洗液瓶洗液瓶 酒精灯酒精灯等等冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色（95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸干 1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗一 一 半 半G G+ +菌菌G G- -菌菌结晶紫结晶紫卢戈氏碘液卢戈氏碘液95%

13、95%乙醇乙醇石碳酸复红石碳酸复红初染 媒染 脱色 复染结果图一图二 无菌操作（接种环灭菌和取菌） 涂片的厚度要适中 染色的时间控制，一一半半 冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗 观察后将玻片放入玻片缸中注意事项 意义意义1.1.鉴别细菌鉴别细菌2.2.研究与致病性的研究与致病性的 关系关系3.3.指导临床用药指导临床用药G G+ +G G- -G G+ + 致病致病 外毒素外毒素G G- - 致病致病 内毒素内毒素G G+ + 青霉素、头孢菌素等青霉素、头孢菌素等G G- - 链霉素、庆大霉素等链霉素、庆大霉素等细菌的特殊结构（示教）细菌的特殊结构（示教）（二毛荚一胞）（二毛荚一胞）从细胞质的基

14、础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H H抗原）抗原）菌毛比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属物菌毛比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛。，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛。功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质。功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质。荚膜细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度0.2m0.2m边

15、界边界明显者称为荚膜，厚度明显者称为荚膜，厚度0.2m0.2m者称为微荚膜。者称为微荚膜。功能：荚膜护菌强致病功能：荚膜护菌强致病-抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗干燥作用、黏附作用。抗干燥作用、黏附作用。菌体内部物质缩水（菌体内部物质缩水（6060）形成圆或卵圆形小体。）形成圆或卵圆形小体。功能：芽胞形态辨细菌，功能：芽胞形态辨细菌，灭菌标准抗力强。灭菌标准抗力强。芽胞油镜的使用方法1. 寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。2. 增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。3. 转高倍镜头、滴加镜油、换油

16、镜头：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。4.调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按：低倍高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。5.清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。物物 镜镜工作距离工作距离(mm)(mm)低倍目镜低倍目镜105.40高倍目镜

17、高倍目镜400.39油镜头油镜头1000.11 实验报告 在封皮上标注班级和第4实验室革兰染色一、目的二、原理（主要通透性）三、材料四、方法五、结果（2+4幅图）六、意义七、注意事项作业重点1 1、绘制所涂片染色的G G+ +及G G- -菌的形态图并注明放大倍数（红蓝铅笔）2 2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注明放大 倍数（铅笔）2.细菌在细菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象 混浊：大多数细菌 沉淀：多见于链状排列的细菌。 菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌） 。细菌在半固体培养基中的生长细菌在半固体培养基中的生长现象现象有动力 现象无动力 现象 通透性学说通透性学说G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易脱除染料。G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易脱除染料。冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色（95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸干 1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗荚膜细菌细胞壁外包绕的一层粘液性