临床ELISA检验影响因素5ppt课件

1、临床临床ELISAELISA检验影响要素检验影响要素保定市疾控中心艾滋病初筛中心实验室 临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定方式 标本的搜集保管 试剂预备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判别 结果报告及解释等方面用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清浆，有时由于特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上运用血清标本测定的标志物普通有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的搜集，要留意搜集时间甚或体位有能够会对测定结果产生影响。如可的松在早晨46点之间，会有一峰值出现

2、：生长激素、促黄体激素LH和促卵泡激素FSH均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在亲密相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的搜集那么没有时间和体位方面的影响，只是在处置和保管方面要思索以下几个方面： 一一. .临床标本的搜集和保管临床标本的搜集和保管1要留意防止出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标志酶的ELISA测定中，如血清标本

3、中血红蛋白浓度较高，那么其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面参与的HRP底物反响显色。 2样本的采集及血清分别中要留意尽量防止细菌污染，一那么细菌的生长，其所分泌的一些酶能够会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二那么一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标志的测定方法产生非特异性干扰。 3血清标本如是以无菌操作分别，那么可以在28下保管一周，如为有菌操作，那么建议冰冻保管。样本的长时间保管，应在-70以下。 4冰冻保管的血清标本须留意防止因停电等呵斥的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀

4、亦应留意，不要进展猛烈振荡，反复颠倒混匀即可。 5标本在保管中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 在临床实验室，对试剂预备普通不太留意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有能够影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的预备最为关键的是，在实验开场前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进展测定，以使试剂盒在运用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反响步骤中，能使反响微孔内的温度能较快地到达所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA

5、试剂盒中的洗板液均需在实验室运用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，那么底物溶液应在反响显色前暂时配制二、试剂预备在如今的ELISA商品试剂盒中，血清样本的参与几乎是独一的要运用微量加样器参与样本的步骤。运用微量加样器加样必需留意的关键点是：加样不可太快，要防止加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对临近孔产生污染。出现气泡那么反响液界面有差别。试剂的参与在国产试剂盒中根本上均是从滴瓶中滴加，除了要留意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加

6、太快，很容易出现反复滴加或加在两孔之间的景象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用一样的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 三、加血清样本及反响试剂三、加血清样本及反响试剂 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个要素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反响在固相上进展，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必需在一定的温度条件下反响一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，那么所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37和室温，其次是43和28。温育这一步是临床EL

7、ISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反响温育时间为37 30分钟1小时，进口ELISA试剂盒那么通常为37 12小时才干有较完全的结合，低于1小时，能够会影响测定下限。因此，关于温育，在实践测定操作中一定要留意以下几点： 四、温育四、温育1要保证在设定的温度下有足够的反响时间。普通来说，加完样本和/或反响试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需求一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的形状下，这段升温时间能够还比较长，而在临床实验室中，很少有人留意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开场计时，这样就很容易呵斥实践测定中温育时间不够

8、，弱阳性样本测不出来的问题。这能够就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节不同室温下微孔板从室温拿至温箱后需求多长时间孔内温度才干到达37，从而适当延伸板条在温箱中的放置时间。详细的做法是，用一小温度计放置板孔反响溶液中丈量察看即可。 2温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的阐明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37下1小时，另一种那么为43下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反响的本质来看，在较低的温度下反响较长的时间最为完全。如28下反响24小时。较高的反响温度，

9、由于分子运动的加怜惜，反响时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本那么有漏检的能够。因此，建议在临床ELISA测定中尽量运用较低温育温度较长反响时间的条件。3“边缘效应的排除。以前在运用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应的缘由能够为96孔板周孔与中心孔外表或热力学特征的不同。但有研讨证明在温育中的热力学梯度能够是根本缘由之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温通常在25左右置于37温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间能够存在一热力学梯度。因此运用水浴或在将反响

10、溶液参与至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度如37，就可以很容易地排除“边缘效应，并且可提高测定的反复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简一方法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会由于板条孔底部直接与37水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反响溶液的温度迅速与温室平衡。 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反响温育过程中吸附的非特异成份别分开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其

11、关键的一步。以HRP作为标志酶的ELISA试剂盒中运用的洗板液普通为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团构成疏水键，从而减弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结协作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可到达去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是经过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要留意非离子去垢剂的运用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体

12、解吸附而影响实验的测定下限 ： 五、洗板五、洗板 在临床实验室中，ELISA测定的洗板普通有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反响温育后，将反响液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置23分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。反复上述洗涤步骤34次，最后在吸水纸上拍干，即可进展下一步测定操作。洗板机洗板那么是将上述手工操作改由洗板机进展，运用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。 在目前的以HRP作为标志酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，那么提供的底物为A和B两瓶运用液；如

13、以OPD为底物，那么试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。普通商品试剂盒显色反响条件为37或室温反响1530分钟。从实际上说，3730分钟才可以使HRP的底物催化反响完全，虽然在最初的10分钟内，绝大部份催化反响即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37下反响2530分钟后，终止反响比色测定。 此外，在参与底物开场显色反响前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，察看能否有显色出现，如有，那么阐明底物已蜕变。以OPD为底物，配好后应为无色，否那么就不能运用。以TMB为底物，整个显色反响过程无需避光，而以OPD为底物

14、，那么需避光进展。关于TMB和OPD的显色反响特点及留意点可参考前面有关章节内容。显色反响完成后，参与酸终止反响，振荡混匀后即可进展下面的比色测定或肉眼判别结果。 六、显色六、显色 ELISA的比色测定由酶标仪进展，有的同行能够会以为，既然由酶标仪进展，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，由于当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，运用不当，会得到令人难以了解的结果。如运用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大添加等等。这主要是没有正确地了解和运用酶标仪所致。至于如何正确了解和运用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点： 七、比色七、比色1比色测定时，

15、一定要留意酶标仪的波长能否已调至适宜或所用滤光片能否正确。由于有的临床实验室在进展ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有运用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时改换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 2单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪根本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进展比色测定；而双波长双色那么酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反响特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物

16、所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改动波长至一定值，使得样本测定酶反响特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，普通不用设空白孔。如在运用双波长比色时，仍设空白孔，就能够会呵斥前面提到的测定孔吸光度为负数的景象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有能够得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是运用

17、双波长比色。八、结果断定 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中能否含有待测抗原或抗体作出“有或“无的结论，分别用“阳性和“阴性来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判别特定病原体感染的存在与否。而定量测定那么是对标本中待测抗原的多少进展量值测定，以详细数值表示。定量测定根本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。ELISA定性测定的“阳性和“阳性的断定根据是试剂盒所确定的阳性断定值Cut-off。定量测定的“量值根据是试剂盒中所带规范品同时测定得出的剂量反响曲线又称规范曲线。下面再解

18、释一下在ELISA定性测定结果断定中常用的一些缩写。 1S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定方式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 2S/N或P/N：其中S同1，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient患者的简写。较早的试剂盒很多都运用S/N或P/N2.1为阳性断定规范，现仍有一些试剂盒运用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照N的2.1倍视为Cut-off值而已。九、结果报告及解释 临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定那么报出详细