高敏乙肝病毒检测临床意义

1、1 1 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer 2009 PerkinElmer高敏HBV检测临床意义及产品考评工作汇报珀金埃尔默医学诊断孙祥杰 电话：152021265162 2Our mission 愿景.for a healthier today and an even better tomorrowDedicated to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人类的健康和促进我们生活环境的安全3 3国际治疗路线HBV优化治疗路线图

2、策略优化治疗路线图策略* 由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供4 4各指南推荐的治疗终点 AASLD 2007 APASL 2008 EASL 2009HBeAg(+) CHB 患者患者HBeAg血清转换血清转换 (唯一的终点唯一的终点) HBeAg血清转换血清转换和和/或或HBV DNA检测检测不不到到HBsAg 血清清除血清清除 (“理想的终点理想的终点”) HBeAg 血清转换血清转换(“满意的终点满意的终点”) HBV DNA检测不检测不到到 HBeAg(-) CHB患者患者HBsAg血清血清清除清除 HBV DNA检测不到检测不到 以及以及ALT正常化正常化 HBsA

3、g 血清清除血清清除 (“理理想的终点想的终点”) HBV DNA检测不检测不到到 5 5美肝会指南2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。6 6欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBV DNA病毒载量尽可能控制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的复发。欧肝会指南7 7乙型肝炎病毒定量检测试剂注册申报技术指导原则乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量检测试剂注册申报技术指导原则8 8行业标准9 9专家意见庄庄辉、鲁凤民等辉、鲁凤民等，慢性慢性乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义定量

4、检测的临床意义2012年年1010临床一线对超灵敏检测试剂需求旺盛临床阶段临床阶段 HBV DNA定量的目的定量的目的开始治疗前 确定患者乙肝感染的基线水平 选择针对性的药物 避免盲目用药治疗过程中 评估抗病毒治疗的效果 及时监测是否发生耐药 预测肝硬化、肝癌的发生风险治疗末期 确定治疗终点 为医生什么时候停止治疗提供可靠依据治疗结束 每3-6个月定期监测HBV-DNA水平，监控疾病复发v传统传统定量定量产品满足不了临床产品满足不了临床需求需求 1111临床用核酸提取试剂乙肝定量kit48测试/盒国食药监械（准）字2013第3402077号2013年11月丙肝定量kit24测试/盒国食药监械（

5、准）字2011第3400554号2011年5月核酸提取kit32测试/盒沪青械备20140045号2014年12月1212高灵敏：高灵敏：HBV 检测下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新证)HCV 检测下限：15 IU/ml (预计16年3月拿到新证)国家国家CFDACFDA技术审评中心技术审评中心HBVHBV DNA/HCV RNA DNA/HCV RNA 定量试剂技术审定量试剂技术审评指导原则评指导原则中指出：中指出： HBV DNAHBV DNA最低检测限应最低检测限应 3030IU/mlIU/ml HCV RNA HCV RNA最低检测限应最低检测限应 5050IU/ml

6、IU/mlPKI临床高敏定量检测产品1313方法学方法学 method磁珠法磁珠法 paramagnetic particle method样本类型 sample血清、血浆 serum or plasma上样量 sample volume200400ul检测型别 genotypesHBV A-H基因型线性范围 LOQ20 IU/mL-2*109 IU/mL灵敏度 LOD 20 IU/mL注册证号国食药监械（准）字2013第3402077号HBV产品性能1414高敏乙肝试剂对比试验开展单位 北京大学医学部 上海仁济医院 湖北省人民医院 上海第三人民医院 温州医科大附属第一医院 东营胜利油田中心医

7、院 昆明医学院第一附属医院 沧州传染病医院 中山大学附属第一医院 北京三零二医院1515高敏乙肝试剂对比试验开展单位 浙江PCR培训班现场评价 重庆PCR培训班现场评价 广州PCR培训班现场评价 烟台PCR培训班现场评价16161717一、北大医学部溯源性评价1重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价1818Day 1:Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1R

8、epeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 IU/ml五个浓度值Day 2 & 3: repeat the above testing pattern1. WHO 标准血清盘可溯源性检测方案1919理论值理论值(IU/ml)理论值理论值(lg IU/ml)实测值实测值(lg IU/ml)相对偏差相对偏差(lg IU/ml)标准差标准差 (lg IU/ml)200004.3014.210-0.0910.09520003.3013.248-0.0530.1442002.3012.3120.0110.145501.6991.7240.0250.11120

9、1.3011.4410.1400.225该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的溯源具有良好的溯源性性PKI HBV定量试剂对WHO标准品溯源性检测结果2020灵敏度 WHO标准品（A亚型）2E42E32E25020105LOD can reach to 10 IU/ml；about 70% of 5 IU/ml could be detected.2121Day 1:Genotype B:卫生部临床检验中心（GBW09150）Genotype C:中国药品生物制品检定研究院Genotype D: SeraCare公司（ WWHD301-10 ）Rep 1Rep 2Rep 3Rep 4Rep 5R

10、ep 6Genotype B/C/DPanelPKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 和200,000 IU/ml六个浓度Day 2 & 3: repeat the above testing pattern2. HBV B/C/D亚型的重复性比较方案2222HBV基因基因型型理论值理论值(IU/ml)理论值理论值(lgIU/ml)检测次数检测次数实测值实测值(lg IU/ml)相对相对偏差偏差(lg IU/ml)标准差标准差（lg IU/ml）LognormalCV %HBV B型型2000005.301185.3290.0280.0581.096200004.30118

11、4.3760.0750.1082.46420003.301183.3840.0830.1303.8312002.301182.4200.1190.1215.000501.699181.7760.0050.1649.235201.301181.4480.1470.23916.502HBV C型型2000005.301185.3240.0230.0160.307200004.301184.3200.0190.0190.44020003.301183.3070.0060.0381.1652002.301182.340.0390.0421.815501.699181.7170.0180.0985.75

12、4201.301181.4340.1330.1278.863HBV D型型 2000005.301185.145-0.1560.0751.462200004.301184.251-0.0500.0721.69920003.301183.187-0.1140.1605.0082002.301182.229-0.0730.2179.756501.699181.684-0.0150.25815.341201.301181.3010.0000.28722.068PKI HBV定量试剂对HBV B/C/D亚型标准血浆检测精密度评价该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性2323重复性

13、临检中心标准品（B亚型）2E52E42E32E2503 repeat tests each concentration20System shows good repeatability2424Rep 1Rep 2Rep 3高浓度假病毒颗粒PKI 稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11个浓度值试剂盒线性范围： 20-109 IU/ml3. 线性范围评价方案2525改良Doumas法该该试剂的试剂的线性范围可达到（线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析改良Doumas法2626E9E8E7E6E5E4E3E25020negativeSyst

14、em shows good linear relationship in the concentration range of 201E9IU/ml.线性范围图27274. 临床血清盘评价双盲法对比测试84例临床样本符合率100%其中2例样本低于两种检测试剂的检测下限20 IU/ml，两种试剂均可检出。Deming regression（图）分析结果显示：两中试剂的相关性较好（r=0.968，p0.0001）；二者关系为PKI=0.340+0.975*Roche；总符合率：总符合率：100%PKIposnegRochepos440neg040Correlation with Roche 282

15、8该HBV定量检测试剂在溯源性、精密度及线性范围方面均有良好表现，临床样本检测与进口试剂具有良好的相关性。试剂考评结论2929二、上海仁济医院溯源性评价/准确度评价1批内/批间重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价5检测限评价3030Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、100、1,000、10,00

16、0 IU/ml五个浓度值1. WHO 标准品准确度检测方案3131该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的溯源性和准确度具有良好的溯源性和准确度PKI HBV定量试剂准确度检测结果3232Day 2 & 3 & 4: repeat the above testing pattern2. 重复性比较方案批内重复:Rep 16次10号样本（2E7）浓度稀释至3E5，共8mlPKI 10号样本（2E7）浓度稀释至3E3，共8ml批间重复:Rep 4次9个5次方浓度样本混合成8ml，分装4管PKI 9个3次方浓度样本混合成8ml，分装4管Day1:Day 1: 直接测试直接测试16次次3333批内重复性检

17、测结果该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性(Coefficient of Variance)3434批间重复性检测结果该该HBV定量试剂定量试剂具有良好的重复性具有良好的重复性3535Rep 1Rep 2Rep 3高浓度假病毒颗粒PKI 稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11个浓度值试剂盒线性范围： 20-109 IU/ml3. 线性范围评价方案3636改良Doumas法该该试剂的试剂的线性范围可达到（线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析Correlate37374. 临床样本评价方案8次方浓度样本8个PKI 3

18、次方浓度样本8个7次方浓度样本8个2次方浓度样本8个6次方浓度样本8个5次方浓度样本8个4次方浓度样本8个1次方浓度样本8个Roche 对比3838临床对比结果3939临床对比结果1098765432110987654321S0.258789R-Sq98.8%R-Sq(adj)98.8%lgRochelgPKIFitted Line PlotlgPKI = - 0.1344 + 1.054 lgRoche40405. 检测限评价方案Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg n

19、egative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 5PKI 稀释至50、20、10 IU/ml3个浓度值Repeat 3Repeat 44141检测限结果4242三、湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360相对相对于过柱于过柱法提取，磁法提取，磁珠方法提取珠方法提取全血有更高全血有更高的得率的得率4343湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360将全血原倍样本重复提取将全血原倍样本重复提取3次测试，并稀释次测试，并稀释5倍、倍、10倍测试，倍测试，结果表明磁珠方法提取全血具有更好

20、的重复性、梯度关系结果表明磁珠方法提取全血具有更好的重复性、梯度关系4444湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360Group260/230260/280QIAGENPKIQIAGENPKI2.42.22.01.81.61.41.21.0DataIndividual Value Plot of 260/280, 260/2304545四、北京302医院精密度46464747四、北京302医院临床样本对比y = 1.0032x - 0.2171R2 = 0.9726012345678012345678PE-HBV测定值测定值roche-HBV测定值测定值线性拟合图与roche线性拟

21、合图线性 (线性拟合图)线性 (与roche线性拟合图)4848四、北京302医院棋盘交叉污染测评4949Unbeatable SOLUTION Magnet offRotation onMagnet onMagnetic Beads based on (PVA) 1 m chemagic Separation TechnologyBloodSaliva / SwabsPlasma(Pathogens)Standard Kits for:5050Pre-NAT技术特点-3转移磁珠而不采用转移液体的方式进行核酸提取，可以有效的减少气溶胶的产生几率，具有良好的防污染效果，而且可以极大的减少样本处理

22、时间。用旋转磁棒的方式进行液体搅拌，从而确保磁珠完全重悬并释放杂质。能够避免磁棒振动模式混匀、或者吹吸混匀的气溶胶产生的风险。通过电磁铁控制磁场，磁珠被转移到下一个提取组分中，无需转移液体。5151防污染措施1. 紫外灯消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋转式混匀，液面上升幅度小，可防止液体喷溅。3. 转移磁珠的方法，减少了液体/气溶胶暴露的机会，从而减少污染。4. 废弃枪头处理方式：直接打到专用垃圾袋，防止含病原体的枪头污染台面。5. 每次实验后进行仪器清洁：75%酒精擦拭台面。6. 使用滤芯枪头。7. MSM1排风口引到pre-NAT外部，防止气流回流造成污染。8. 设有移液回吸动作，防止

23、阳性样本滴出造成污染。5252试验煮沸法合计阳性阴性PerkinElmer 阳性04747阴性033合计05050表1 相对符合率分析五、与国内煮沸法HBV 低于500 IU/ml 样本结果测评分析1E3-E5 IU/ml8%500-1E3 IU/ml9%100-500 IU/ml23%20-100 IU/ml28% 10-20 IU/ml13%0-10 IU/ml19%50例临床阴性例临床阴性样本样本PE高敏高敏试剂实测结果试剂实测结果简要分析：简要分析：q 国产试剂HBV PCR试剂500IU/ml的样本50例，均报告阴性例，均报告阴性结果结果;q 使用Perkinelmer HBV PC

24、R试剂只检出3例阴性，其余其余47例均有检测例均有检测结结果果；q 20IU/ml浓度以上假阴性率达到64%以上，且个别结果达到E4 E5高浓度样本漏检； 可见普通煮沸法可见普通煮沸法HBV 定量试剂临床漏检率特别定量试剂临床漏检率特别高，给临床诊治带来错误的诊断治疗依据。高，给临床诊治带来错误的诊断治疗依据。5353试验一步法合计阳性阴性PerkinElmer 阳性13092222阴性06464合计130156286表2 相对符合率分析与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-1115152371112412014345417232440.2%5.2%8.0%2.4%0.3%0.3

25、%43.4%42.0%4.9%11.9%18.9%5.9%8.0%8.4%0%5%10%15%20%25%30%35%40%45%50%0204060801001201401000500-1000100-50020-10010-200-101000500-1000100-50020-10010-200-100圣湘PE阳性数阳性率一步法一步法 HBV PCR试剂对比试剂对比情况分析情况分析：q PE与一步法平行对比HBV样本，总计286例；q一步法定量下限500IU/ml，即有156个样本报阴性或无结果，PE定量下限20IU/ml，总计64个样本不报结果。实际有92个弱阳性标本被漏报，占总检测数

26、量的32.17%，风险相当大；5454国产：曲线平台期不明显，扩增效率低 重复性一般。PE：曲线呈典型S曲线，扩增效率高 重复性非常好5555一一步法步法 HBV PCR试剂对比情况分析：试剂对比情况分析：q 两例样本结果两种试剂差异较大，复测；q 一步法HBV试剂检测准确性差，因杂质未去除，试剂抗干扰抗干扰能力差能力差，重复性差重复性差，不稳定。q PE HBV 高敏试剂抗干扰能力强，稳定，重复性好。抗干扰能力强，稳定，重复性好。与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-2样本样本1一步法一步法内标未起跳内标未起跳PE1.78E+06 IU/ml复测复测复测复测原倍原倍内标仍未起跳

27、内标仍未起跳1.7E+06 IU/ml稀释稀释10倍倍3.9E+05IU/ml样本样本2一步法一步法9.92E+02IU/mlPE9.26E+01 IU/ml复测复测复测复测1.36E+02IU/mlPE9.68E+01 IU/ml5656Real time PCR普通普通PCRPKI-超灵敏超灵敏PCRPCR上样量上样量2ul40ul体系20ul60ul 提取提取DNA 方法学方法学 煮沸法磁珠法优缺点（纯度纯度）杂质多 扩增效率低 纯度纯度高 扩增效率高(1+x)n=AF ，109 PCR产物分子高灵敏的关键要素5757 PerkinElmer 全自动核酸检测反应体系构建系统-Pre-NAT仪器型号：Pre-NAT条码扫描：原始管上机，条码扫描读取仪器大小：2300mm x 810mm x 950mm样本通量：196个样本处理体积： 最大1.2ml液体加样范围：5ul800ul处理时间：2小时完成96个样本的PCR体系构建加样器：4通道磁场控制：电磁铁提取方法：磁珠法-转移磁珠5858 Pre-NAT 工作流程Pre-NAT 工作站工作站核酸提取、扩增前核酸提取、扩增前PCR反应体系构建等过程反应体系构建等过程无需人工操作无需人工操作将您从繁琐的操作中解放出来将您从繁琐的操作中解放出来Walk away5959Pre-NAT 四大模块6060Pre