实验六细胞核和线粒体的荧光观察

1、一、实验目的实验目的学习荧光显微镜的工作原理及使用方法学习荧光显微镜的工作原理及使用方法了解荧光探针了解荧光探针RhodamineRhodamine 123 123 和和Hoechst33342 Hoechst33342 与细与细胞成分的结合特性和光谱特性胞成分的结合特性和光谱特性二、实验原理二、实验原理1. 1.荧光显微镜荧光显微镜 细胞参量细胞参量荧光探针荧光探针 吸收吸收/发射发射 nm特性特性DNA和和RNAPropidum iodide(PI) 535/617 红色荧光红色荧光 嵌入核酸双链间嵌入核酸双链间,只能标记死细胞只能标记死细胞.用于用于 染色染色体体,细胞观察细胞观察,分辨

2、死活细胞和细胞周期研究分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidium bromide(EB)518/605红色荧光红色荧光嵌入核酸双链间嵌入核酸双链间,只能标记死细胞只能标记死细胞.用于电泳用于电泳分析分析,染色体观察染色体观察DAPI 358/461 蓝色荧光蓝色荧光半通透细胞半通透细胞,结合于结合于DNA的的AT碱基对碱基对.用于细用于细胞周期的研究胞周期的研究,染色体和细胞核的观察染色体和细胞核的观察Hoechst33342 350/461 蓝色荧蓝色荧光光结合于结合于DNA的的AT碱基对碱基对,可进入活细胞可进入活细胞,用于用于细胞周期的研究细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察染色体和细胞

3、核的观察蛋白和抗体的蛋白和抗体的耦联探针耦联探针FITC 494/518 绿色荧光绿色荧光染死细胞染死细胞,对对PH值变化不敏感值变化不敏感Texas red 595/615 红色荧光红色荧光多参量细胞标记多参量细胞标记溶酶体溶酶体Neutral red 541/640 红色荧光红色荧光探针微偏碱性探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细可标记溶酶体等酸性细胞器胞器线粒体线粒体Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光黄绿色荧光可进入活细胞可进入活细胞,阳离子性阳离子性,摄入快摄入快,淬灭快淬灭快,无毒性无毒性常用荧光探针介绍常用荧光探针介绍 Hoechst33342 Hoechst33

4、342和和RhodamineRhodamine 123 123 Ho.33342Ho.33342是一种亲脂性物质，能与是一种亲脂性物质，能与DNADNA特异性特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射特性分别为定量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm350nm和和461nm461nm。 罗丹明罗丹明123123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明有负电荷，而罗丹明123123具有

5、正电荷，二者电性相吸。具有正电荷，二者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射特性为发射特性为507nm507nm和和529nm529nm。l 仪器仪器 荧光显微镜，倒置显微镜荧光显微镜，倒置显微镜材料材料 A549A549、WI-38 pc-3WI-38 pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸、载玻片，盖片，滴管，滤纸试剂试剂PBSPBS缓冲液缓冲液pH7.4pH7.4Ho.33342Ho.33342储存液储存液:1mg/mL(:1mg/mL(溶于溶于PBS)PBS)罗丹明罗丹明123123储存液储存液: 1mg/mL(: 1mg/m

6、L(溶于甲醇溶于甲醇) )将盖玻片上的细胞用将盖玻片上的细胞用PBSPBS缓冲液轻轻漂洗缓冲液轻轻漂洗2 2次次4.4.在在parafilmparafilm 膜上分别滴加膜上分别滴加Ho.33342Ho.33342和罗丹明和罗丹明123123工作工作液各液各1010 L L，将盖玻片上的细胞倒扣在，将盖玻片上的细胞倒扣在parafilmparafilm 膜上室温膜上室温暗处孵育暗处孵育10min10min。5.5.在在parafilmparafilm 膜上加膜上加PBSPBS缓冲液，待盖玻片被冲起后，缓冲液，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片再轻轻揭下盖玻片, ,用用PBSPBS缓冲液轻轻漂洗

7、缓冲液轻轻漂洗2 2次。次。6.6.利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。配制配制Ho.33342和罗丹明和罗丹明123 工作液工作液:Ho.33342 (10g/mL), 罗丹明罗丹明123(10g/mL)（溶于（溶于PBS缓冲液，缓冲液，pH7.4）将盖玻片上的细胞用将盖玻片上的细胞用PBSPBS缓冲液轻轻漂洗缓冲液轻轻漂洗2 2次，次，分别滴加分别滴加Ho.33342Ho.33342和罗丹明和罗丹明123123工作液各工作液各1010 L L，室温暗处孵育室温暗处孵育10min 用用 PBS缓冲液轻轻漂洗缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成的次，放在载玻片上制成的小室上小室上利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻