细胞融合与单克隆抗体PPT学习教案

1、会计学1细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体第2页/共43页第3页/共43页v 70 70年代年代,(,(华裔加籍华裔加籍) )高国楠高国楠 PEGPEG促植物原生促植物原生 质体的融合质体的融合v 80 80年代，电融合年代，电融合第4页/共43页现代植物细胞融合的开始 1978年（德）梅歇尔斯“potomo”第5页/共43页“Pomoto ”第6页/共43页第7页/共43页动物细胞融合 动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。第8页/共43页肿瘤细胞与树突状肿瘤细胞与树突状细胞的融合细胞的融合第9页/共43页人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合

2、1978年年(瑞士瑞士)埃勒门埃勒门斯斯 (美国美国)柯路斯柯路斯第10页/共43页第11页/共43页物理法物理法:电场刺激电场刺激 激光激光 显微操作显微操作 化学法化学法:聚乙二醇聚乙二醇(PEG)结合高结合高pH、 高钙离子法高钙离子法生物法生物法:仙台病毒仙台病毒第12页/共43页来来 源源前处理前处理融合方法融合方法主要应用主要应用动物细胞动物细胞不需不需仙台病毒、仙台病毒、PEGPEG、电融合电融合生产单克隆生产单克隆抗体抗体植物细胞植物细胞脱壁脱壁PEGPEG、电融合、电融合创造植物新创造植物新品种品种微生物细胞微生物细胞脱壁脱壁PEGPEG高产优质新高产优质新菌种菌种第13页/

3、共43页也称日本血凝病毒也称日本血凝病毒HVJHVJ，属粘病毒副流感，属粘病毒副流感类群，是类群，是RNARNA病毒，多型颗粒状，易在小病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。鼠中蔓延。 第14页/共43页仙台病毒诱导仙台病毒诱导第15页/共43页仙台病毒诱导仙台病毒诱导第16页/共43页仙台病毒诱导仙台病毒诱导第17页/共43页PEG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) 商品名：卡波蜡(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH实验室用实验室用PEG平均分子量在平均分子量在20020,000一般：一般：1,000固体固体常用分子量：常用分子量：400060

4、00PEG诱诱导导第18页/共43页？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生 变化变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。故。 ？PEG诱诱导导第19页/共43页PEG诱诱导导第20页/共43页PEG诱诱导导悬浮法：将细胞悬于悬浮法：将细胞悬于40405050的的PEG4000PEG4000进行进行 溶，处理溶，处理1 12 2分钟为宜。分钟为宜。离心法离心法：先将细胞混合物悬于先将细胞混合物悬于30304040的的 PEG4000PEG400

5、0，再离心进行融合，则可适，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以当延长融合时间，以5 58 8分钟为宜。分钟为宜。 第21页/共43页l 辅以辅以515的的DMSO或在融合前用或在融合前用 PHA处理一下，效果更好。处理一下，效果更好。PEG诱诱导导第22页/共43页PEG诱诱导导PEG融合法缺点 对细胞有毒性第23页/共43页PEG诱诱导导第24页/共43页电融合诱电融合诱导导机制机制在直流电脉冲的诱导下, 原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化, 使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体第25页/共43页电融合诱电融合诱导导第26页/共43页u

6、融合效率高，可达融合效率高，可达5080u产生杂交细胞的频率高，是产生杂交细胞的频率高，是PEG法的法的100倍。倍。 u操作简便、稳定，但需设备。操作简便、稳定，但需设备。u对细胞无毒害作用。对细胞无毒害作用。u可在显微镜下观察操作。可在显微镜下观察操作。电融合诱电融合诱导导第27页/共43页视野内全部细胞的细胞核总视野内全部细胞的细胞核总数数 100融合率融合率=第28页/共43页成株成株第29页/共43页组织的获得组织的消化组织的消化诱导细胞融合形成杂种细胞 筛选，培养第30页/共43页第31页/共43页比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合的原理细

7、胞融合的原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法去处细胞壁后诱去处细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（显微操作、物理（显微操作、电融合）电融合）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体第32页/共43页 (1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则 者较易融合；表面光滑者较难融合。(2) 细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及

8、株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞 几乎不融合。 (3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙 台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于 37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量 呈正比。但在34 振摇则融合率下降。在 37时不振摇则几乎不融合。 影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素第33页/共43页(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋 白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等离子可代替Ca2+但有效浓度较Ca2+大 的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L(6)最适合的pH为7478之间，在此范围之外， 融合率均较低。影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素第34页/共43页第35页/共43页第36页/共43页异核体异核体(heterokaryon）多核体（多核体（polykaryon）异胞质体异胞质体(heterocybrid)第37页/共43页同源