第八章免疫标记技术

1、123456Veterans Administration Hospital Bronx, NY, USA 7891011RIARIA测定原理的定量示意图测定原理的定量示意图 Ag* Ag Ab AgAb 游离游离Ag B/F B/T6/2 6/83/5 3/82/6 2/84/4 4/812返回131415161718返回19返回202122常常用用的的荧荧光光素素返回2324252627(1)免疫荧光法免疫荧光法 ：直接法直接法: 简单、快速、特异简单、快速、特异; 敏感性差。敏感性差。 28返回29 间接法间接法: 可检测多种不同的抗原抗体复合物，可检测多种不同的抗原抗体复合物，具一定通

2、用性；敏感性高具一定通用性；敏感性高; 但操作流程长、但操作流程长、干扰因素多。干扰因素多。 3031补体荧光染色法：补体荧光染色法：将荧光素标记在补体的抗体上（抗将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗抗体），检测抗原抗体复合物。体），检测抗原抗体复合物。n可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高；但操作流程长、干扰因素多、敏感性高；但操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。备不方便。323334返回353637 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIG

3、WIGWIBWIB38返回39404142流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry, FCM) 是七十年代发展起来的高科学技术是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, , 同同时具有时具有分析和分选细胞分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状部颗粒的性状, ,还可还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNADNA、RNARNA含量等含量等, ,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、在血液学、免疫学

4、、肿瘤学、药物学、分子生物学分子生物学等学科广泛应用。等学科广泛应用。 4344FACS组成示意图组成示意图Fluorescence-activated cell sorter (FACS)46流式细胞仪实验原理流式细胞仪实验原理4748表达量检测表达量检测 49细胞凋亡研究细胞凋亡研究 PI染色染色50AV-PI双染色双染色51血液学应用血液学应用：包括包括DNA倍倍体分析及细胞周期分析，淋体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微能分析和血小

5、板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，吞噬功能测定，NK和和LAK细胞活性测定，造血干细胞活性测定，造血干/祖祖细胞测定等细胞测定等 52胞内细胞因子的检测胞内细胞因子的检测53T细胞亚群分析细胞亚群分析545556一、原理一、原理E：酶；：酶；S:底物；底物；P:有色产物；有色产物；D1：供氢体；：供氢体；D2：D1的氧化型有色化合物的氧化型有色化合物将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。575859606162二、基本类型二、基本类型1. 均相酶免疫测定法均相酶免疫测定法 酶增强免疫技术；酶减弱免疫技术；酶增强免疫技术

6、；酶减弱免疫技术；辅基标记技术辅基标记技术2. 非均相酶免疫测定法非均相酶免疫测定法 ELISA (直接法、间接法、夹心法、竞直接法、间接法、夹心法、竞争法、抗酶抗体法）争法、抗酶抗体法）63直接直接ELISA间接间接ELISA6465返回666768返回697071返回727374加加Ab,清洗清洗加加Ag形成复形成复合物，洗涤合物，洗涤加该加该Ag的另的另一一Ab（酶（酶标），洗涤标），洗涤加底物，读数加底物，读数加加Ag，清洗，清洗加加Ab形成复形成复合物，洗涤合物，洗涤加酶标二抗加酶标二抗加底物，读数加底物，读数聚苯乙烯微聚苯乙烯微量反应板量反应板7576抗酶抗体法（抗酶抗体法（PAP

7、）77血清IgE的检测n实验材料n酶标板（聚苯乙烯微量板）n马抗人抗体（购自北京中山公司）n辣根过氧化物酶（）标记的马抗人抗体n待检血清n包被缓冲液：碳酸钠碳酸氢钠洗涤液n封闭液：溶液n反应终止液：78实验方法实验方法包被酶标反应板：加马抗人抗体（），孔 孵育小时后洗涤次，分钟次，孔，过夜孔孵育后，洗涤同上酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，孔孵育后， 洗涤同上底物：加入（邻苯二胺）溶液，孔室温分钟终止液：加入，孔内，用酶标仪测定各孔值，测定波长实验结果 用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值（） 表示，当大于某一数值时（如）判断为阳性，数值的大小依具体检测要求而定。798

8、081b b固相抗原竞争法固相抗原竞争法返回82夹心夹心ELISA竞争竞争ELISA83返回8485返回86酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot, ELISPOT) 在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（附法（ELISAELISA）检测体液中游离的细胞因子（）检测体液中游离的细胞因子（CKCK）或抗体，但由于游离的循环抗体或或抗体，但由于游离的循环抗体或CKCK的半哀期不同，的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与使之在体液中不断的被代谢或与靶器官靶器官结合，而不结合，而不能确切的反映体内的抗体及能确切

9、的反映体内的抗体及CKCK的水平。的水平。8080年代，国年代，国外的科研工作者根据外的科研工作者根据ELISAELISA技术的基本原理，建立技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和了体外检测特异性抗体分泌细胞和CKCK分泌细胞的固分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（相酶联免疫斑点技术（ELISPOTELISPOT）。因其具有较高）。因其具有较高的的特异性特异性和和敏感性敏感性，目前正被国内外广泛应用，对，目前正被国内外广泛应用，对探索自身探索自身免疫免疫系统疾病发病机制具有重要意义。系统疾病发病机制具有重要意义。 8788nELISA通过通过显色显色反应，在反应，在酶标仪酶标仪上测定吸

10、光度，与标准曲上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。线比较得出可溶性蛋白总量。n ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，分析系统对斑点进行计数，1个个斑点代表斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率

11、）胞因子的细胞频率）n由于是由于是单细胞单细胞水平检测，水平检测，ELISPOT比比ELISA和有限和有限稀释稀释法等更灵敏，能从法等更灵敏，能从 20万万-30万万 细胞中检出细胞中检出 1个个 分泌该蛋白分泌该蛋白的细胞。的细胞。n捕获抗体为捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。会影响活化细胞分泌细胞因子。8990919293949596979899100返回101102返回103104返回105返回106107返回

12、108高度特异性高度特异性 高度灵敏性高度灵敏性 简单快速安全稳定简单快速安全稳定109（1）生物素、亲合素、）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性链霉亲合素的特性生物素（生物素（biotin，B）又称维生素又称维生素H、辅酶、辅酶R（羧基转化酶的辅酶）（羧基转化酶的辅酶） MW 244.31， pI 3.5 分子式为分子式为C10H16O3N2S 110111112又称卵白蛋白、抗生物素。又称卵白蛋白、抗生物素。 MW 68,000，pI 1010.5，为碱性蛋白，含糖量高，为碱性蛋白，含糖量高达达10%； 1个亲合素可与个亲合素可与4个生物素结合；个生物素结合； Ka = 1015 mol/L

13、 113链霉亲合素（链霉亲合素（streptavidin，SA）：）：返回114 活化生物素可结合或偶联抗体、酶、蛋活化生物素可结合或偶联抗体、酶、蛋白质、多肽、激素、凝集素、糖类及白质、多肽、激素、凝集素、糖类及DNA 、RNA等等115116返回117四、四、ELISA方法的发展方法的发展1. 酶联免疫荧光测定法酶联免疫荧光测定法1182. IgM型抗体捕捉酶联免疫吸附试验型抗体捕捉酶联免疫吸附试验 （IgM antibody capture ELISA,MAC-ELISA)1193. 斑点酶联免疫吸附试验（斑点酶联免疫吸附试验（dot- ELISA)120121三、免疫金溶胶技术三、免疫

14、金溶胶技术122 胶体金试纸条诊断胶体金试纸条诊断是采用斑点免疫层析是采用斑点免疫层析技术研制而成，该技术是技术研制而成，该技术是9090年代初在免疫渗年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）等检测。）等检测。（4）斑点免疫层析试验）斑点免疫层析试验 （ dot immunochromatographic assay, DICA)123 胶体金胶体金（Colloidal g

15、oldColloidal gold）是氯金酸）是氯金酸（HAuClHAuCl4 4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。电作用成为一种稳定的胶体状态。124质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。形，大小均一，无棱角。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。各异。胶体金的质量判定标准胶体金的质量判定标准125p胶体金标记的原理：胶体金标记的原理：胶体金在

16、碱性条件下带胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合。吸引而形成牢固结合。p胶体金标记技术胶体金标记技术（Immunogold labeling Immunogold labeling techniquetechnique）是以胶体金作为示踪标记物应）是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。126原原 理理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗血管作用，滴加在膜条一端的

17、液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原（红色）反应，检测抗原/ /抗体。最常用双抗夹心抗体。最常用双抗夹心法检测抗原。法检测抗原。胶体金试纸条示意图胶体金试纸条示意图检测线检测线质检线质检线吸收垫吸收垫样品垫样品垫硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜连接垫连接垫（胶体金垫）（胶体金垫）背衬背衬（底板）（底板）128p测定时将试纸条下端浸入液体测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经液体向上端移动，流经C C处时使处时使干片上的干片上的免疫金复合物免疫金复合物复溶，复溶，并带动其向膜条渗移。并带动其向膜条渗移。测测 定定129p若标本中有待测特异抗原，即若标本中有待测特异抗原，即可与免疫金复合物中的抗体结可与免疫金复合物中的抗体结合，此抗原抗体复合物流至测合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获，在膜试区即被固相抗体捕获，在膜上显出红色上显出红色反应线条反应线条（T T）。）。测测