毕业论文统一格式 (1)

1、本科生毕业论文（设计）题 目: 南通小方柿的组织培养体系和植物再生体系建立 姓 名: 刘鲁玉 学 院: 园艺学院 专 业: 园艺专业 班 级: 园艺101班 学 号: 14110108 指导教师: 渠慎春 职称: 教授 2014 年5 月 20 日南京农业大学教务处制本科生毕业论文（设计）规范化要求（说明：本表供农理工科专业学生用，以下所有红色、蓝色文字仅供参考，学生在写作论文时请保留字体、字号，改写或删除掉文字，黑色文字请保留。每一页的上方(天头)和左侧(订口)分别留边25mm，下方(地脚)和右侧(切口)应分别留边20mm，装订线5 mm，页眉和页脚为5 mm。论文题目使用黑体三号字，正文使

2、用宋体小四号字，行距为单倍行距；一级标题段前段后为0.5行，正文段前段后为0，字符间距为标准。为保证打印效果，学生在打印前，请将全文字体的颜色统一设置成黑色。以上说明参阅后请自行删除，包括本文本框！）（顶头空2行）目 录（4号黑体，居中）摘要1关键词1Abstract1Key words1引言11 材料与方法Y1.1 材料 Y1.2 方法 Y1.2.1 Y1.2.2 Y1.2.3 Y1.2.4 Y2Y2.1Y3 Y（略）X （正文第X章）Y致谢Y参考文献Y附录A （必要时）Y附录B （必要时）Y图1 （必要时）Y图2 （必要时）Y表1 （必要时）Y表2 （必要时）Y注：1. 目次中的内容一般列

3、出“章”、“节”、“条”三级标题即可；2X、Y表示具体的阿拉伯数字；南通小方柿的组织培养体系和植物再生体系建立园艺专业学生 刘鲁玉指导教师 渠慎春摘要：本研究以涩柿（Diospyros kaki Linn）品种南通小方柿（Diospyros kaki Linn. cv.Nantongxiaofangshi）为材料，以当年生枝条上的休眠芽为外植体较系统的研究建立了该品种的外植体初代、继代增殖培养等技术体系，以期为小方柿的生理生化及遗传转化方面的研究等奠定技术基础，同时也也为我国唯一的矮生型柿品种-南通小方柿的快速繁育和生产推广提供了技术途径。主要研究结果如下：1.使用10%的双氧水对南通小方柿一

4、年生枝条上的休眠芽消毒10min、20min的成活率分别是68 %和80%，外植体无褐化现象，成活率高。消毒时双氧水分解产生的活性氧对小方柿休眠芽的萌发、生长有促进作用，同时还有效解决了休眠芽初代褐化死亡的问题。2.培苗继代培养4-5代后用（1/2N）MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+GA30.05mg/L+PVP500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L和（1/2N）MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+PVP500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L培养基交替培养，增殖系数达到6.5，可有效解决南通小方柿因没有丛生苗不能增殖扩繁的问题

5、。关键词：柿；组织培养；初代培养；继代培养Study on Tissue Culture and Plant Regeneration of Persimmon(Diospyros kaki Linn. cv.Nantongxiaofangshi)Student majoring in horticulture LiuLuyu Tutor QuShenchunAbstract：Dormant buds taken from one year old persimmon branches,as in vitro explants materials,to study the early gene

6、rations, subculture, leaf callus and buds induction. The paper laid the foundation of study the dwarfing mechanism from molecular aspects and physiological traits aspects.At the same time promote the rapid breeding and production promotion of this dwarf varieties of persimmon.Results as following:1、

7、Use 10%H202 on dormant buds for disinfection 10min and 20min, the survival rate was 68% and 80%,Disinfection effect is obviously better than use 5%NaClO and 0.1%HgCl. Reactive oxygen species can promote dormant buds germinate which produced by the decomposition of hydrogen peroxide. Solved the probl

8、em of dormant buds easy browing and death.2、 Seedlings that subcultured in vitro for 4 5 generations, were cultured in media of（1/2N）MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+GA30.05mg/L+PVP500mg/L+Sucrose 30g/L+ Agar 6.0g/L and （1/2N）MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+PVP500mg/L+ Sucrose 30g/L+ Agar 6.0g/L by turns.

9、Axillary buds of the previous generation were cut and inserted into the appropriate media for propagation, with each medium for 25 30 days. Using this procedure can effectively solve the problem that Diospruskaki Linn. cv. Nantongxiaofangshi couldnt be propagated in vitro with lack of clump seedling

10、s. Key words: Persimmon(Diospyros kaki);tissue culture; primary culture; subculture引言:柿树通常为高79米的落叶乔木。传统上主要采用君迁子、油柿、野柿等优良砧木进行嫁接繁殖1。但是常规繁育方法周期长，成活率低，嫁接良种树形高大、结果较晚、为管理带来不便2。1982年江苏省进行果树资源调查时，在南通市发现了具有矮生性状的地方品种南通小方柿（Diosp rus kaki Linn. cv.Nantongxiaofangshi）(当地俗称小方柿、四丫红)。该品种的树高、冠径、新梢长度、粗长比以及节间长度均显著地小于同

11、龄大方柿和朱砂红，表现出明显的矮生树结构特性3。南通小方柿树体矮小，早果性好，且丰产稳定，果实色艳、无核、质优，能自然脱涩，是矮化密植栽培的优良柿品种。对我国今后柿树的栽培管理、育种、果品生产及其发展产生深远的影响4。本研究针对柿树传统的繁殖方法是砧木嫁接移栽成活率和嫁接后存活率都较其他果树低，在前人研究的基础上，首次建立了矮生型树品种南通小方柿的组培快繁技术。以休眠芽为外植体的初代培养和继代增殖培养的基本规律，筛选出适合南通小方柿组培苗生长的初代、继代培养基基本解决了南通小方柿初代褐化严重的问题，初代成活率达到80%。通过添加适量赤霉素以及筛选特定的基础培养基与不同种类、浓度的细胞分裂素，解

12、决了南通小方柿继代增殖问题。促进了矮生型柿品种南通小方柿的快速繁育和生产推广工作。南通小方柿快繁技术的研究，为快速获得大量苗木提供可能，促进了矮生型柿树种产业在我国的推广和快速发展。同时，小方柿组培苗再生体系的建立为生理研究及分子方面研究其矮化机理性状等奠定了基础。1 试验材料11 南通小方柿一年生枝条于2012年11月取自江苏省盐城市东台县农业示范园内，树龄约为3年。12在0.05mg/LNAA+(1/2N)MS+1mg/LZT的培养基上继代了3-5代的南通小方柿组培苗作为继代增殖培养试验的的材料。2 试验方法21外植体的灭菌及接种前处理南通小方柿休眠芽从枝条上切下剥去芽的外部2-3片鳞片，

13、在肥皂水中洗涤芽2-3遍，流水冲洗2小时减轻外植体表面微生物污染程度。用75%酒精表面灭菌30s， 分别按以下三种方法进行后续消毒：（1）在含有10%H2O2溶液中分别浸泡10min、20min，浸泡过程中要不时摇动，使双氧水分解产生大量氧气起到杀菌作用。最后用无菌水冲洗3-5次;（2）在含有0.1%吐温-80的5%NaClO(安替福民)溶液中浸泡10min，浸泡过程中要不时摇动，最后用无菌水冲洗3-5次;(3) 在含有0.1%吐温-80的0.1%HgCl:(升汞)溶液中浸泡10min，浸泡过程中要不时摇动，最后用无菌水冲洗3-5次。将经过不同方法消毒的休眠芽接种于含有500mg/LPVP(聚

14、乙烯毗咯烷酮)不添加生长素和细胞分裂素的基本培养基上，每个处理60瓶，2周后统计成活率。2.2不同基本培养基对南通小方柿组培苗初代的影响萌动生长的休眠芽分别接种在含有ZT1.0mg/L+NAA0.05mg/L的MS、1/2MS、MS(1/2N)培养基上培养2代后观察统计组培苗的生长情况及植株高度，比较基本培养基对南通小方柿组培苗初代生长的影响。2.3基本培养基、 ZT和NAA组合对休眠芽初代培养的影响基本培养基、激素的种类及浓度对休眠芽萌动生长的影响，采用L9（34）正交试验设计，其因素水平如表1.水平因素基本培养基ZT(mg/L)NAA(mg/L)1(1/2N)MS10.0521/2MS20

15、.13MS40.32.4不同浓度赤霉素对南通小方柿继代增殖影响将组培苗接种到含有0.0，0.05，0.1GA3的（1/2N）MS+ZT1.0mg/L+0.1mg/LIAA的培养基中生长2代后，统计组培苗的生长情况，比较赤霉素在组培苗生长中的作用。3 培养条件 试验所用培养基中的蔗糖浓度为3%，琼脂浓度均为0.6%，PVP(聚乙烯毗咯烷酮)500mg/L，pH值为5.7-5.8；培养基经121(0.105-0.12MPa)高温湿热灭菌15min，组培苗培养温度均为25左右，光照时间16h/d，在光照强度为1500-2000lx的白炽灯下培养。4 数据分析方法用SPSS20.0 软件以对试验数据进

16、行统计分析。5 结果与分析5.1. 不同消毒方法对南通小方柿初代影响如图2-1，用次氯酸钠和升汞消毒的休眠芽虽然消毒效果好污染率低但是褐化严重成活率低，分别为54%、40%。双氧水对休眠芽进行消毒10min、20min的成活率分别是68%和80%，外植体无褐化现象，成活率高。同时消毒时双氧水分解产生的活性氧还对小方柿休眠芽的萌发、生长有促进作用。所以小方柿休眠芽接种前消毒处理时可采用酒精表面灭菌30s，双氧水浸泡消毒20min（需不停晃动），最后用无菌水冲洗3次的方法。使用10%的双氧水对外植体进行消毒处理不仅对外植体没有毒害，同时还有促进生长的作用，且有效解决了休眠芽初代褐化严重的问题明显提

17、高了初代成活率。 图2-1：不同消毒剂对休眠芽初代培养的影响Figure 2-1: Effect of different disinfectants on primary culture of dormant buds5.2不同基本培养基对南通小方柿休眠芽初代影响 如表2-1所示， (1/2N)MS培养基中的组培苗明显高于其他两种培养基，并且长势好，叶片大翠绿，基部愈伤小组织小。1/2MS和MS培养基培养的组培苗高度之间差异不显著，并且组培苗长势弱，基本呈莲座状生长，生长缓慢茎很短，没有丛生苗形成，叶片呈黄绿色并且部分褐化，基部愈伤组织大，尤其是在MS培养基中生长的萌发休眠芽叶片褐化严重甚至

18、死亡不利于继代扩繁。说明柿子外植体萌发生长需要较低浓度的矿质元素，尤其是较低浓度的氮素。表2-1.不同基本培养基对南通小方柿组培苗增殖影响Table 2-1. Different effects of basic medium on micropropagation of Nantongxiaofangshi peisimmon培养基平均株高（mm）长势描述(1/2N)MS15.9a苗较高、叶片大翠绿、基部愈伤小1/2MS12.6b苗长势较弱、叶片发黄部分褐化、基部愈伤大MS11.0b苗长势弱、褐化严重、基部愈伤大注:结果中小写字母表示显著水平P=0.05，以下同如图2-2所示，采用改良培养基

19、(1/2N)MS培养的组培苗植株平均高度为15.9mm，1/2MS和MS培养基中生长的小方柿株高分别为12.6mm，11.0mm。连续在(1/2N)MS培养基中的组培苗明显高于其他两种培养基，而1/2MS和MS培养基中生长的组培苗株高没有明显差异，植株矮小。南通小方柿组培苗在培养基中增殖主要靠节间的腋芽，所以植株高度是反应组培苗增殖效果的重要指标之一。通过三种基本培养基的比较研究发现改良的(1/2N)MS培养基适于南通小方柿组培苗的初代增殖生长。图2-2：不同基本培养基对南通小方柿组培苗高度的影响Figure 2-2: Different effects of basic medium on

20、Height of Nantongxiaofangshi peisimmon5.3 基本培养基、 ZT和NAA组合对休眠芽初代培养的影响 试验结果表明（表2-3，图2-3），培养基和NAA三个水平的极差值最大，说明培养基和NAA对休眠芽的萌发影响较显著。在(1/2N)MS中生长的休眠芽萌发较好植株高，其次是1/2MS培养基，MS培养基中生长的休眠芽长势最差。休眠芽的生长状况跟培养基中的矿质元素含量的多少有关，随着培养基中氮素含量的增加萌发出的叶片褐化较严重，基部愈伤较大。NAA的浓度对休眠芽的生长影响较大，高浓度的NAA促进诱导休眠芽基部的愈伤组织生长，从而影响休眠芽的萌发。培养基中ZT的浓度

21、对休眠芽的生长影响不明显。处理7组合0.3mg/LNAA+MS+1mg/LZT中的休眠芽全部长愈伤；处理1组合0.05mg/LNAA+(1/2N)MS+1mg/LZT中生长的休眠芽萌发后植株最高，长势最好。从正交试验直观分析图中可看出ZT对休眠芽的萌发影响最小，NAA的影响较大，培养基的影响最大，但差异不显著。综上所述，组合1：0.05mg/LNAA+(1/2N)MS+1mg/LZT更适合初代休眠芽的萌发生长。表2-3：基本培养基、 ZT和NAA组合对休眠芽初代培养的影响Table 2-3:Effects of basic medium, ZT and NAA combination on p

22、rimary culture of dormant buds组合基础培养基ZTNAA平均株高（mm）1(1/2N)MS10.0513.4a2(1/2N)MS20.110.4b3(1/2N)MS40.36.8c41/2MS10.110.0b51/2MS20.36.1c61/2MS40.058.7bc7MS10.30d8MS20.058.6bc9MS40.17.0c5.4 不同浓度GA3(赤霉素)对南通小方柿继代增殖影响由于南通小方柿组培没有丛生苗形成，所以实验采用其有效腋芽进行扩繁增殖。赤霉素可促进细胞分裂，也可显助促进细胞伸长，有利于组培苗的叶片扩大、茎延长和侧枝生长。如表3-1所示，在培养基

23、中分别加入0.05、0.1mg/L赤霉素培养一个月后与对照不加赤霉素相比植株明显长高腋芽数增加，茎明显伸长，有效提高了小方柿的扩繁增殖率。随着赤霉素浓度增加植株高度和腋芽数都有所增加，叶片数变化不大，但是在赤霉素作用下的组培苗长势明显变弱，随着浓度增加叶片逐渐变小变窄，当浓度大于0.1mg/L时叶片呈黄绿色柳叶状，且植株变矮褐化。用浓度为0.05mg/L的赤霉素诱导植株腋芽的萌发和茎生长，再用不加赤霉素的培养基进行壮苗培养可以有效提高南通小方柿的增殖倍数，植株叶片翠绿长势旺盛，并且在株高显著高于含有赤霉素浓度0.00、0.05、0.1mg/L的培养基单独培养的组培苗。说明在柿子继代时加入少量的

24、赤霉素可促进柿子组培苗的茎伸长和腋芽萌发有利于增殖扩繁。可用ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA0.05mg/L与ZT1.0mg/L+IAA0.1mg/L培养基交替培养进行组培苗的快速繁殖。图2-3：正交试验直观分析Figure 2-3:Analysis of observation results from orthogonal test表3-1：不同浓度GA3(赤霉素)对南通小方柿继代增殖影响Table3-1:Effects of different concentrations of GA3 on micropropagation of Nantongxiaofangshi p

25、eisimmonGA浓度（mg/L）株高（mm）腋芽数（个）性状描述0.00 15.40a3.05a叶片过大深绿色，植株矮小0.05 22.10b5.05b叶片与茎比例适中，淡绿色0.10 25.40b6.45c叶片小黄绿色0.00与0.05交替培养 34.85c6.50c叶片与茎比例适中，鲜绿色注：表中不同小写字母表示差异达到0.05显著水平。下同。Note：different small letters indicate significant (P0.05)6 讨论 柿是栽培果树当中植株含有单宁和酚类物质较多的树种，在组织培养操作及培养过程中外植体极易出现褐化现象，直接影响了组培苗的正常

26、生长和继代增殖。所以在一开始初代培养时就该注意预防和减少褐化发生。在对博爱八月黄柿的休眠芽、萌动芽和梢尖进行消毒时间和消毒剂对其组培的影响的研究后发现，对污染率、褐变率、成活率的比较发现，0.1%HgCl2消毒效果好于不同浓度的NaClO消毒效果31。NaClO和HgCl2这两种灭菌剂虽然消毒效果很好，但是次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料有一定的破坏作用；而升汞容易在植物材料上残留不易清除且毒性强31，对于酚类物质含量高的柿外植体使用这两种消毒剂消毒容易导致柿外植体褐化，降低成活率。本研究使用10%的双氧水对外植体进行不同时间的消毒处理后虽然污染率较次氯酸钠和升汞高，但是外植体基本不发生褐化。

27、双氧水不仅在外植体上无残留没有毒害，同时H2O2分解产生的活性氧有促进生长的作用有效解决了休眠芽初代褐化严重的问题明显提高了初代成活率。MS培养基是木本植物组织培养里应用最为广泛的一种基础培养基95。在外植体的早期生长培养阶段，许多研究表明MS(1/2N)或l/2 MS培养基要好于MS培养基，培养基中氮素含量过高不利于芽的启动增殖培养17。实验通过三种基本培养基的研究结果与前人研究结果基本一致，发现南通小方柿初代萌发的幼苗在(1/2N)MS培养基上生长良好，植株较l/2 MS和MS培养基上生长的幼苗叶片绿，植株高，基部愈伤组织小。赤霉素在果树组织培养中应用较多的是GA3，GA3能够刺激器官生长

28、，但是会抑制器官发生，在器官形成以后添加GA3可促进器官或胚状体生长。GA3会抑制不定根的形成，但在根原基形成后，GA3不影响不定根生长38。与生长素作用不同的是GA3对整个植株所起的作用比对离体器官或组织所起的作用更明显96 。在前人对柿的组培研究中还未见通过添加赤霉素来促进继代增殖的报道。本研究比较了不同浓度的GA3对小方柿继代增殖的影响后发现，培养基中添加赤霉素促进了小方柿的腋芽萌发和茎伸长，但是随着GA3浓度升高组培苗长势变弱，叶片变小，植株发黄不利于继代增殖。由此可知低浓度的赤霉素可以促进小方柿组培苗茎和腋芽的生长，添加赤霉素的培养基和不添加赤霉素的培养基交替培养组培苗可明显提高增殖

29、系数。实验中还发现无论是在初代培养还是在继代培养中，组培苗基部都有愈伤组织形成，而且随激素浓度升高，基部愈伤组织生长也越大。愈伤组织过度生长会影响组培苗营养的吸收，使组培苗上部生长受到抑制，一般基部愈伤组织大的组培苗其上部叶片大部分发黄褐化严重的甚至脱落死亡。因而继代增殖培养中应调节激素浓度，减少愈伤组织生成，对磨盘柿和上西早生柿离体繁殖研究中也出现了相同情况98。致谢本论文是在导师渠慎春教授的悉心指导下完成的。导师在学业上的精心指导和生活上的无私关怀都让我铭记在心。导师渊博的知识、严谨的治学态度、开阔的眼界、结合生产的实践精神以及宽宏的为人态度让我受益匪浅。从论文选题、试验设计到论文的撰写、定稿，都倾注了渠老师大量的心