第十八章电泳

1、生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 基本概念、分类及原理基本概念、分类及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳毛细管电泳 印迹法（转移电泳）印迹法（转移电泳）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009

2、) 2009电泳技术的发明及发展电泳技术的发明及发展11809年，俄国年，俄国物理学家物理学家Ress首次发现电泳首次发现电泳现象现象21937年，诺贝尔年，诺贝尔奖金获得者奖金获得者Arne Tiselius教授，发教授，发明了最早期的界明了最早期的界面电泳，用于蛋面电泳，用于蛋白质分离的研究，白质分离的研究，开创了电泳技术开创了电泳技术的新纪元。的新纪元。3近几十年以来，电近几十年以来，电泳技术发展很快，泳技术发展很快，各种类型的电泳技各种类型的电泳技术相继诞生，在生术相继诞生，在生物化学、医学、免物化学、医学、免疫学等领域得到了疫学等领域得到了广泛应用。广泛应用。生命科学学院：叶薇生命科

3、学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009电泳电泳 概念：带电颗粒在电概念：带电颗粒在电场作用下，向与其电场作用下，向与其电荷相反的电极移动的荷相反的电极移动的现象。现象。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 显微电泳显微电泳 自由界面电泳自由界面电泳：在没有支持介质的溶液中进行的电泳 区带电泳区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散。是是目前常用的电泳系统目

4、前常用的电泳系统生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009纸电泳纸电泳淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：多用于核酸核酸的分离聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质核酸和蛋白质的分离生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009聚丙烯酰胺凝胶电泳结果聚丙烯酰胺凝胶电泳结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1 2 3 4 5 6 7 8 M kDa97.2

5、66.444.329.020.114.3生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009l 根据支持介质形状不同，可分为：根据支持介质形状不同，可分为：薄层电泳板电泳柱电泳 据用途不同，可分为：据用途不同，可分为：分析电泳制备电泳定量电泳免疫电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 电泳是在电场作用下产生的物质运动。电泳是在电场作用下产生的物质运动。 在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，带电颗粒带电颗粒(分子分子

6、)在电在电场中的迁移方式主要依据场中的迁移方式主要依据分子分子大小和形状大小和形状、分分子所带子所带电荷电荷或或分子的分子的生物学与化学特性生物学与化学特性。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009若将带净电荷若将带净电荷q q的颗粒放入电场，则受到的电荷引力为的颗粒放入电场，则受到的电荷引力为 F F引引=E=Eq q在溶液中在溶液中, ,运动颗粒遵循运动颗粒遵循Stokes Law（斯托克斯定律）（斯托克斯定律） F F阻阻=6r=6rV V 当当F F引引=F=F阻阻时时 E Eq = 6rq =

7、 6rV V V=V= (1)(2)(3)E Eq q6 6r r(4)生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 颗粒的泳动速度与颗粒形状有关。颗粒的泳动速度与颗粒形状有关。 如非球形分子（如线状如非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受）在电泳过程中受到更大的阻力。到更大的阻力。颗粒的移动速度颗粒的移动速度(泳动速度泳动速度V)与电场强度与电场强度(E)和和颗粒所带电荷量颗粒所带电荷量(q)成正比成正比,而与颗粒的半径而与颗粒的半径(r)及及溶液的粘度溶液的粘度()成反比。成反比。生命科学学院：叶薇生

8、命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 由由（4 4）可知，带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，可知，带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电颗粒在不同电场里泳动速度不同，为了使得同一种带电颗粒在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率便于比较，常用迁移率 m m（指带电颗粒在单位电场强度（指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示颗粒的泳动情况。下的泳动速度）代替泳动速度表示颗粒的泳动情况。 m = V/E = q/6rm = V/E = q/6r （5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，

9、迁移率仅与球形颗粒所带电荷数迁移率仅与球形颗粒所带电荷数 量，颗粒大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。量，颗粒大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009影响电泳的因素影响电泳的因素1.颗粒性质：电荷、直径、形状颗粒性质：电荷、直径、形状2.电场强度电场强度3.溶液性质：溶液性质：pH、离子强度、溶液黏度、离子强度、溶液黏度4.电渗电渗5.焦

10、耳热焦耳热6.筛孔筛孔生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 电泳和电渗属于胶体的电动现象。电泳和电渗属于胶体的电动现象。在电场作用下溶液相对于与其接触的在电场作用下溶液相对于与其接触的固定的支持物作相对运动的现象。固定的支持物作相对运动的现象。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20

11、09 支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr） 双体，交联剂：N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，Bis） 催化剂作用下聚合为凝胶 分为连续系统与不连续系统两大类。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺结构式甲叉双丙烯酰胺结构式CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CHCH2 2 NH NH C

12、=O C=O CH CH2 2=CH=CHN,N-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（Bis）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009(1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2) 化学性能稳定化学性能稳定；(3) 对对pH和温度变化较稳定和温度变化较稳定；(4) 几乎无吸附和电渗作用几乎无吸附和电渗作用；(5) 样品不易扩散，且用量少，

13、其灵敏度可达10-6g(6) 凝胶孔径可调节凝胶孔径可调节；(7) 分辨率高分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。聚丙烯酰胺凝胶的一般特性聚丙烯酰胺凝胶的一般特性生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 不连续垂直不连续垂直柱状柱状凝胶电泳凝胶电泳 不连续垂直不连续垂直板状板状电泳电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 连续的连续的盘状盘状凝胶电泳和垂直凝胶电泳和垂直板状板状电泳电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双

14、向电泳双向电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶合成聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 分离效应分离效应生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009凝胶总浓度（凝胶总浓度（T）：）： Acr和和Bis在凝胶中的总浓度。在凝胶中的总浓度。交联度（交联度（C）：）： Bis占总浓度的百分含量占总浓度的百分含量Acr（g）+B

15、is（g）V（ml）X100%T=X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）C=丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)和双丙烯酰胺和双丙烯酰胺(Bis)含量的确定含量的确定凝胶孔径的大小由凝胶孔径的大小由T和和C决定决定生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009T与与C的关系的关系 一般而言，一般而言，C随随T的增加而降低的增加而降低 T一定时，一定时，C为为5%时，凝胶孔径最小。因时，凝胶孔径最小。因此目前有些实验室采用此目前有些实验室采用a:b=19:1 a:b100，凝，凝胶呈糊状，易断裂。胶呈糊状，易断

16、裂。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 凝胶孔径大小主要受凝胶总浓度凝胶孔径大小主要受凝胶总浓度(T)的影响。的影响。 凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。也易断裂。 当凝胶浓度确定后，交联度为当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最时，凝胶具有最小孔径，超过小孔径，超过5%或低于或低于5%时凝胶孔径都要增大时凝胶孔径都要增大 凝胶总浓度凝胶总浓度(

17、T)和交联度和交联度(C)与孔径大小的关系与孔径大小的关系生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009标准胶：在总浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(C

18、http:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶合成聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 分离效应分离效应生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 化学催化系统：化学催化系统： 是在是在引发剂引发剂和和加速剂加速剂组成的系统中完成的。组成的系统中完成的。有碱性系统和酸性系统有碱性系统和酸性系统 光催化系统光催化系统生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyri

19、ght(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009引发剂：过硫酸铵（引发剂：过硫酸铵（Ammonium persulfate, AP）加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）、二甲基丙腈、）、二甲基丙腈、 二甲二甲基丙腈亚硫酸盐基丙腈亚硫酸盐 微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基，这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009引发剂：过硫酸铵引发剂：过硫酸铵(AP)

20、过氧化氢过氧化氢加速剂：硫酸亚铁加速剂：硫酸亚铁-抗坏血酸（抗坏血酸（Vc) 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009引发剂：核黄素引发剂：核黄素加速剂：加速剂：TEMED可以加速聚合可以加速聚合 核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基，核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基，引发聚合反应。引发聚合反应。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009引发剂加速剂应用范围过硫酸铵过硫酸铵（AP）N,N,N,N-四甲基乙二胺四

21、甲基乙二胺（TEMED）碱性系统碱性系统3-二甲胺丙腈3-二甲胺丙腈亚硫酸盐过氧化氢或AP硫酸亚铁-抗坏血酸酸性系统核黄素TEMED碱性系统（光聚合）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 化学聚合的凝胶孔径小，透明度好，重复性也较好，但AP可能影响蛋白质活性。 光聚合的凝胶对分析样品无任何不良影响，但凝胶呈乳白色，透明度较差生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009聚合影响因素聚合影响因素 大气氧能淬灭自由基，

22、阻止多聚体链长的增加。在大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，进行化学聚合前，在胶液表面，往往覆盖一层水或在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。溶液，隔绝空气，可加速聚合。 低温会减慢聚合反应速度。低温会减慢聚合反应速度。 有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。抑制聚合反应。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶合成聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺和双丙烯酰

23、胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 分离效应分离效应生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。其分离效应包括： 浓缩效应(不连续系统浓缩胶中不连续系统浓缩胶中) ) 电荷效应 分子筛效应 系统的不连续性表现在以下方面：系统的不连续性表现在以下方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成凝胶由上、下两层凝胶组成 上层为大孔径的浓缩胶上层为大孔径的浓缩胶 下层为小孔径的分离胶。下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成、各层凝胶的缓冲液离子组成、各层凝胶的p

24、H不同不同 电极缓冲液为电极缓冲液为pH8.3的的Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 浓缩胶为浓缩胶为pH6.7的的Tris-HCl缓冲液缓冲液 分离胶为分离胶为pH8.9的的Tris-HCl缓冲液。缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度在电场中形成不连续的电位梯度pH8.3pH8.3pH8.9pH6.7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009浓缩效应浓缩效应（1 1）凝胶孔径不连续性：）凝胶孔径不连续性： 在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小

25、，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层两层凝胶交界处凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带很窄的区带 pH8.3pH8.3pH8.9pH6.7生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 在浓缩胶中pH6.7的Tris-HCl缓冲液解离出Cl-，在电场中迁移率快前导离子或快离子。 甘氨酸在pH8.3的电极缓冲液解离出NH2CH2COO-，在电场中迁移率很慢尾随离子或慢离子。 酸性蛋白在浓缩胶中解离后带负电荷（pHpI） 。 电泳开始时，在电流

26、的作用下，浓缩胶中Cl-有效泳动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而G1y在最后面。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 电泳初期，快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低电导区。 低电导区有较高的电场强度，使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。在快、慢离子间在快、慢离子间的蛋白质样品的蛋白质样品就在这个追赶过程中被逐渐地压缩聚集压缩聚集成一条狭窄的区带。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyr

27、ight(C) 2009) 2009电荷效应电荷效应 当样品进入分离胶后当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009分子筛效应分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应分子筛效应。 颗粒小，形状为圆球形的分子，通过凝胶孔时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大，形状不规则的分子，通过凝

28、胶的阻力较大，移动慢。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 不连续垂直不连续垂直柱状柱状凝胶电泳凝胶电泳 不连续垂直不连续垂直板状板状电泳电泳 连续的连续的盘状盘状凝胶电泳和垂直凝胶电泳和垂直板状板状电泳电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳双向电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009不连续垂直柱状凝胶电

29、泳不连续垂直柱状凝胶电泳 装置：电泳槽、玻璃管、电泳仪生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009一般操作一般操作 步骤： 摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样：浓缩胶缓冲液加样：浓缩胶缓冲液+样本样本+蔗糖蔗糖/甘油甘油+指示剂指示剂 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009加样需注意加样

30、需注意 制备样品时，离子浓度不宜太高 蔗糖浓度小于20% 样品液中的沉淀和混浊需除去 阴离子系统用溴酚蓝作指示剂，负极在上；阳离子系统用甲基绿或次甲基绿作指示剂，正级在上。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009一般操作一般操作 步骤： 摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样加样 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/

31、Copyright(C) 2009) 2009 固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测 染色法染色法 荧光探针法 特殊试剂染色法生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009染色法染色法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝(G250,R250,R350)、氨基黑、阿乐辛蓝、过碘酸-Schiff试剂 银试剂 光显色： 化学显色： 双胺银染色法 非双胺银染色法 多银染色法 干胶快速银染色法 考马斯亮蓝-银染色法生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C)

32、2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20091 2 3 4 5 6 7 8 M kDa97.266.444.329.020.114.3考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色银染银染生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测 染色法 荧光探针法荧光探针法 特殊试剂染色法生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyri

33、ght(C) 2009) 2009荧光探针法荧光探针法 先荧光标记（荧光胺等），再电泳 先电泳，后荧光检测（MDPF、OPA、ANS、Bis-ANS）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测 染色法 荧光探针法 特殊试剂染色法特殊试剂染色法生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009特殊试剂染色法特殊试剂染色法 用途：用于某些酶类检测 方法种类： 直接染色法：适合分子量小

34、的底物或反应产物。如氧化还原酶（脱氢酶） 电泳染色法：适合分子量大、难于进胶的底物。如水解酶 指示胶染色法：适合分子量大的底物、多酶参与的反应系统生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009谱带保存谱带保存 凝胶成像法 直接摄影法 凝胶干燥法（长期保存）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 不连续垂直不连续垂直柱状柱状凝胶电泳凝胶电泳 不连续垂直不连续垂直板状板状电泳电泳 连续的连续的盘状盘状凝胶电泳和垂直凝胶电

35、泳和垂直板状板状电泳电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳双向电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 优点： 表面积大，温度好控制 一块凝胶可点多个样品 凝胶易取出 可作双向电泳 操作： 胶板模具的制备 凝胶板的制备 加样和电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇htt

36、p:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 不连续垂直不连续垂直柱状柱状凝胶电泳凝胶电泳 不连续垂直不连续垂直板状板状电泳电泳 连续的连续的盘状盘状凝胶电泳和垂直凝胶电泳和垂直板状板状电泳电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳双向电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 连续：连续： 缓冲液、pH、凝胶孔径都相同 只有分离胶、无浓缩胶 分离效应：分离效应

37、：电荷效应和分子筛效应 用途：用途：分离蛋白和核酸（RNA、DNA）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶浓度从上至下直线增加，而聚丙烯酰胺凝胶浓度从上至下直线增加，而孔径则从上到下呈直线降低孔径则从上到下呈直线降低浓度和孔径呈有规律的阶梯式变化的凝胶制成浓度和孔径呈有规律的阶梯式变化的凝胶制成的凝胶柱（或板）的凝胶柱（或板）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 不连续垂直不连续垂直柱状柱状

38、凝胶电泳凝胶电泳 不连续垂直不连续垂直板状板状电泳电泳 连续的连续的盘状盘状凝胶电泳和垂直凝胶电泳和垂直板状板状电泳电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳双向电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 第一维：形成第一维：形成pH梯度进行等电聚焦梯度进行等电聚焦 第二维：第二维：SDS凝胶电泳凝胶电泳 染色：染色： 考马斯亮兰染色或银染考马斯亮兰染色或银染 图像分析：自动扫描图像分析：自动扫描 生命科学

39、学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing PAGE) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE） 在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）或者尿素尿素后，用其作为支持物进行凝胶电泳生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 SDS是阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即

40、带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略 同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致基本原理基本原理（电荷效应）生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 在强还原剂（如巯基乙醇）存在下，可以打开蛋白质分子内或肽链之间的二硫键，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量分子量所决定。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copy

41、right(C) 2009) 2009 主要用途：主要用途： 分离蛋白质分离蛋白质 蛋白亚基分子质量的测定蛋白亚基分子质量的测定生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 凝胶的制备凝胶的制备：用0.1% SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液配置 样品制备样品制备：样品溶于1% SDS- 0.1%巯基乙醇-0.01mol/L磷酸钠缓冲液 电泳条件：电泳条件：电极液（0.1% SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2） 固定与染色固定与染色：考马斯亮蓝生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/

42、 Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009

43、) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009二、尿素二、尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 用于DNA探针和酶解核酸产物的分离，核酸序列分析等。三、三、SDS-尿素尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定分子量10kDa的多肽生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(Isoelectricfocusing-PAGE, IEF-PAGE) 是上世

44、纪60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点分子量相近而等电点不同的蛋白质不同的蛋白质组分。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续pH梯度。 蛋白质是两性电解质，其pI有差异，电泳时分别聚焦于支持物上pH等于各自pI的区

45、域。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009（一）（一）pH梯度的形成梯度的形成（二）电聚焦分离蛋白质（二）电聚焦分离蛋白质生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 将pK和pI各自相异又相近的两性电解质溶液倾入电泳支持物中，电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。 电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸

46、液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于pI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2pI1，因此定位于第一种两性电解质之后。 这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极递增的连续从正极到负极递增的连续pH梯度梯度 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009+

47、pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，当移动至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于该蛋白质分子pI。 同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyrigh

48、t(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20091098765432pHpI8.0蛋白质pI4.0蛋白质生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 载体两性电解质（Ampholine)：多氨基多羧基脂肪族混合物。 理化性质： 缓冲性能强； 导电性能好； 分子量较小； 紫外吸收值低； 一般不与样品起化学反应生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 pH范围选择：测定未知样品的等电点时，一范围选择：测

49、定未知样品的等电点时，一般先采用般先采用pH3-10的两性电解质摸索，初步测的两性电解质摸索，初步测出等电点后，改用包括样品出等电点后，改用包括样品pI值的窄值的窄pH范围范围的两性电解质。的两性电解质。 用量选择：两性电解质通常为用量选择：两性电解质通常为1-2%。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20091、配制凝胶、配制凝胶一般选用凝胶浓度T为5%-7.5%。在等电聚焦中，凝胶只是作为一种对抗对流的支持介质，因此，不考虑分子筛效应。同时，加入一定pH范围的载体两性电解质，以便形成连续的pH梯度生命科

50、学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20092、加样：、加样：直接加在聚丙烯酰胺凝胶溶液中或者加在凝胶柱顶部。3、聚焦：、聚焦：聚焦时电极缓冲液要根据两性电解质载体的pH范围而定，电压恒定在200V/6cm，聚焦6-8h。4、固定与染色、固定与染色：氨基黑、考马斯亮蓝5、样品、样品pH的测定的测定：洗涤冰冻切片测pH6、蛋白质的洗脱、定量、蛋白质的洗脱、定量7、pI的测定的测定：固相pH梯度电聚焦法生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 20

51、09) 2009 1975年OFarrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SDS-PAGE双向电泳。其中IEF电泳（柱状）为第一向，SDS-PAGE为第二向（板状）。 IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。复杂的蛋白质组分。Two dimensional electrophoresis,2DE生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Ch

52、ttp:/ Copyright(C) 2009) 2009双向电泳的重要性双向电泳的重要性 原位细胞提取与样品处理双向电泳双向电泳质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线 双向电泳是研究双向电泳是研究蛋白质组学蛋白质组学的关键技术的关键技术，是深刻认识蛋白质结构与功能的重要工具。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定常用于蛋白质分子量的测定等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IEF)通过蛋白质通过蛋白质pI差异分离

53、蛋白质差异分离蛋白质双向电泳双向电泳是蛋白质组学研究的重要技术是蛋白质组学研究的重要技术生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法； 若需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳； 用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离线性DNA时，迁移率与其分子量密切相关，与碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright

54、(C) 2009) 2009生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009染色染色凝胶成像凝胶成像分析分析结结果果配制电泳缓冲液配制电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶电电泳泳加样加样生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。 电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，低，p

55、H值上升，缓冲性能下降，值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度m/V % (g/ml %)分离线状分离线状DNA的范围的范围（Kbp)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-2生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 DNA样品 + 载样缓冲液(l

56、oading buffer)生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009载样缓冲液的作用载样缓冲液的作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，加样操作更方便。制胶制胶加样加样加入加入EB(0.5ug/ml)EB(0.5ug/ml)生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，

57、对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。 注意：注意：如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009 常用的核酸染色剂是溴化乙啶溴化乙啶(EB)，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。 而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009溴化乙锭溴化乙锭( Ethidiu

58、m bromide, EB)染色染色 EB嵌入嵌入DNA碱碱基基对对之之间，会间，会被紫外光被紫外光激激发发而放出而放出约约600nm的的荧荧光光. EB为为致癌物致癌物，操作操作时务时务必戴上手套必戴上手套!生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009SYBR-Green染色染色 SYBR-Green：荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。 SYBR-Green：广泛用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的RNA 或单链DNA。生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Ch

59、ttp:/ Copyright(C) 2009) 2009SYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 20091. 1. 以紫外以紫外光做光做为为光源光源. .2. 2. 需使用需使用红红或或黄黄色色滤滤光片去除光源干光片去除光源干扰扰. .3. 3. 操作操作时须时须小心小心EBEB, , 务务必戴上手套必戴上手套. . 生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(

60、C) 2009) 200913531078872603310281/271234194118720123456M12(bp)生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 200920kb12kb10kb6kb1.2kb0.8kb生命科学学院：叶薇生命科学学院：叶薇http:/ Copyright(Chttp:/ Copyright(C) 2009) 2009毛细管电泳毛细管电泳 是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度场为驱动力，根据样品中各