第2章 生化制药基本技术

1、第二章第二章 生化制药的基本技术生化制药的基本技术第一节第一节 原料的选择、处理及有效成分的提取原料的选择、处理及有效成分的提取 生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性质不同而存在很大差异。总的来说，其提取纯化一般分为五质不同而存在很大差异。总的来说，其提取纯化一般分为五个步骤：预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括个步骤：预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图所示：干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图所示：生物材料、发酵或培养液生物材料、发酵或培养液预处理（清洗、加热、调预处

2、理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）、凝聚、絮凝）细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞细胞细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）收集上清液收集上清液初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）图图2-1 生化药物提取的一般工艺流程生化药物提取的一般工艺流程上清液（含

3、胞外产品）上清液（含胞外产品）一、原料的选取与保存原料的选取与保存 选择原则：选择原则：有效成分含量高，原料新鲜；有效成分含量高，原料新鲜； 原料来源丰富，易得，原料成本低；原料来源丰富，易得，原料成本低； 原料中杂质含量较少等。原料中杂质含量较少等。植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集并就地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。并就地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用-40速冻；速冻；有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。二

4、、生化药物提取二、生化药物提取1. 物理性质与提取物理性质与提取提取提取是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。态转入特定溶液环境的过程。许多生化药物具有生物活性，其稳定性受许多生化药物具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强、温度、离子强度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。 2. 提取的溶剂系统提取的溶剂系统（1）对水溶性、盐溶性生物物

5、质的提取）对水溶性、盐溶性生物物质的提取 可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。（2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取 可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提取试剂时，根据产物存在的状态可分为液取试剂时，根据产物存在的状态可分为液-液提取和固液提取和固-液液提取。提取。液液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。杂质杂质溶质溶质原溶液原溶液萃取剂萃取

6、剂Light phaseHeavy phase萃取相萃取相原溶液原溶液tC在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称，此常数称为为分配系数分配系数。在常温下为常数；的单位通常用在常温下为常数；的单位通常用mol/L或质量单位或质量单位/mL。萃余相浓度萃取相浓度210CCK工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。乙酯、乙酸丁酯等。表表2 青霉素在不同萃取剂中的分配系数青霉素

7、在不同萃取剂中的分配系数 溶溶 剂剂 pH2.5pH2.5（溶剂（溶剂/ /水）水） pH7.0pH7.0（溶剂（溶剂/ /水）水）乙酸戊酯乙酸戊酯 45/1 1/23545/1 1/235乙酸丁酯乙酸丁酯 47/1 1/18647/1 1/186乙酸乙酯乙酸乙酯 39/1 1/26039/1 1/260氯仿氯仿 39/1 1/22039/1 1/220三氯乙烯三氯乙烯 21/1 1/26021/1 1/260乙醚乙醚 12/1 1/19012/1 1/190物理化学方面物理化学方面有足够的容量有足够的容量与水溶液不互溶，不发生乳化与水溶液不互溶，不发生乳化对产物有高的分配系数对产物有高的分配

8、系数低黏度低黏度在密度上同水有大的差别在密度上同水有大的差别生物学方面生物学方面在消毒过程中热稳定在消毒过程中热稳定经济和毒理方面经济和毒理方面对生物催化剂、酶或活细胞无毒性对生物催化剂、酶或活细胞无毒性低成本低成本能大批供应能大批供应对人员无毒对人员无毒不易燃不易燃表表1 1 在生物转化中萃取溶剂的选择准则在生物转化中萃取溶剂的选择准则固固-液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂很重要，溶剂选择的主要依据是适的溶剂很重要，溶剂选择的主要

9、依据是“相似相溶相似相溶”原原理。理。浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化。溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化。三、细胞破碎技术三、细胞破碎技术植植物物细细胞胞模模式式图图1. 机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎

10、法、机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press等。等。JJ-2组织捣碎匀浆机 珠磨法珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法珠磨是常用的方法u*细胞悬浮液与极细的玻璃细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于磨剂（直径小于1mm）一起）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。内含物。u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机用高速珠磨机WSKWSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机超声波破碎仪

11、 技术技术原理原理效果效果成本成本破碎率破碎率举例举例高压匀浆法高压匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过小孔，须使细胞通过小孔，使细胞受到剪切力使细胞受到剪切力而破碎而破碎剧烈剧烈适中适中50%细胞悬浮液细胞悬浮液大规模处理大规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠剪切碰撞珠剪切碰撞剧烈剧烈便宜便宜90%细胞悬浮液细胞悬浮液和植物细胞和植物细胞的大规模处的大规模处理理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中昂贵昂贵50%细胞悬浮液细胞悬浮液小规模处理小规模处理*不同机械破碎方法的比较不同机械破碎方法的比较2. 非机械法：酶溶法、化学渗透法

12、、反复冻融法、干燥非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等法等 酶溶法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模酶溶法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。四、固液分离四、固液分离固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。 离心：离心：借助离心机旋转所产生的离心力

13、的作用，促使不同大借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。小，不同密度的粒子分离的技术。过滤：过滤：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。第二节第二节 沉淀技术沉淀技术沉淀：沉淀：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。固体凝聚物的现象。根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。等电点沉淀法等

14、。一、盐析法一、盐析法 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（内（0.150.2mol/L）最大，低于或高于此范围时溶解）最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。不同蛋白质盐析时所需的盐发生沉淀的现象称为盐析。不同蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。 常用的盐析用盐包括硫酸

15、铵、硫酸钠、硫酸镁、氯常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等。化钠、磷酸二氢钠等。二、有机溶剂沉淀法二、有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、降低溶向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶剂沉淀法。剂沉淀法。 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。三、等电点沉淀法三、等电点沉淀法 两性电解质在溶液两性电解质在溶液pH处于等电点时，分子表面电处

16、于等电点时，分子表面电荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。分子间引力增加，溶解度降低。 调节溶液调节溶液pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作称为等电点沉淀法。淀的操作称为等电点沉淀法。第三节第三节 色谱技术色谱技术色谱：色谱：也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起迁移速度不同而进行分离相之间分配行为的差别，引起迁移速度不同而进行分离的方法。的方法。固定相：固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以

17、是固体物质固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱

18、时称为展层剂。 一、色谱技术的分类一、色谱技术的分类色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱法、色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。液相色谱法和超临界流体色谱法。根据固定相的形状不同，色谱法可分为柱色谱法、纸色根据固定相的形状不同，色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法。谱法和薄层色谱法。根据分离的机理，可分为吸附色谱法、分配色谱法、离根据分离的机理，可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。 二、柱色谱装置和操作二、柱色谱装置和操作柱色谱一般由进样器、色谱柱、检测柱色谱一般由进

19、样器、色谱柱、检测器、记录仪及部分收集器等部分组成。器、记录仪及部分收集器等部分组成。柱的分离效率与柱高成正比，与直径柱的分离效率与柱高成正比，与直径成反比。成反比。柱色谱操作柱色谱操作（1） 装柱。根据欲分离的物质性质选择适宜的色谱介质，装柱。根据欲分离的物质性质选择适宜的色谱介质，装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢加入，一次用完。然后用几倍柱床体积的缓冲液平衡色谱柱。加入，一次用完。然后用几倍柱床体积的缓冲液平衡色谱柱。（2）加样。将平衡后的色谱柱从柱顶部或底部进样。）加样。将平衡后的色谱柱从柱顶部或底部进样。（3）洗涤

20、。用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与）洗涤。用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与固定相结合的杂质洗涤下来。固定相结合的杂质洗涤下来。（4）洗脱。根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将）洗脱。根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将目的物洗脱下来。目的物洗脱下来。（5）再生。目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附）再生。目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。慢慢中等中等快快淋洗液淋洗液三、吸附色谱三、吸附色谱固定相固定相：固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀粉、

21、活性炭等，较常使用的是粉、活性炭等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使混合溶液中各组分相互分离的方法。混合溶液中各组分相互分离的方法。 混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不

22、同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A 移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因阻滞因数数Rf来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相的移动速度之比。的移动速度之比。Rf =溶质的移动速度溶质的移动速度/流动相的移动速度之比流动相的移动速度之比 =溶质的移动距离溶质的移动

23、距离/流动相的移动距离之比流动相的移动距离之比四、凝胶过滤色谱四、凝胶过滤色谱原理：原理：按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，溶剂分子小，故在最后出峰。故在最后出峰。 1.凝胶过滤色谱的分离机理凝胶过滤色谱的分离机理固定相固定相：凝胶凝胶(具有一定大小

24、孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；2. 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质（1）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶商品名为商品名为Sephadex，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件下交联而成。主要型号是下交联而成。主要型号是G-10G-200。数字是凝胶的吸。数字是凝胶的吸水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的10倍。倍。（2）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶商品名为商品名为Bio-gel-P。主要型号有。主要型号有Bio-gel-P-2 Bio-gel-P-300等等10种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（

25、不不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量）的）的10-3，所，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。以数字越大，可分离的分子量也就越大。（3）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶（4）其他）其他 多孔玻璃珠和多孔硅胶等。多孔玻璃珠和多孔硅胶等。3. 凝胶色谱的应用凝胶色谱的应用（1）脱盐及除去小分热源物质子杂质和溶液的浓缩。）脱盐及除去小分热源物质子杂质和溶液的浓缩。（2）浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶）浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶液进行浓缩。液进行浓缩。（3）生物大分子的纯化及生化药物中热源物质的去除。）生物大分子的纯化及生化药物中热源物质

26、的去除。（4）分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体）分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体积积Ve与其分子量的对数成线性关系。与其分子量的对数成线性关系。五、离子交换色谱五、离子交换色谱固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲

27、和力的大小与离子半径、电荷、存分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；在形式等有关。亲和力大，保留时间长；应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。六、亲和色谱六、亲和色谱原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔有一般反应性能的所谓间隔臂臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连接，再连接上配基上配基(酶、抗原等酶、抗原等)，这种，这种固载

28、化的配基将只能和具有固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。液后洗脱。薄层色谱原理薄层色谱原理2纸层析原理纸层析原理第四节第四节 结晶结晶一、结晶的原理一、结晶的原理1.饱和溶液：饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液； 2.过饱和溶液：过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；称之为过饱和溶液； 3. 晶核：晶核：在过饱和溶液中，最先析

29、出的微小颗粒就是在过饱和溶液中，最先析出的微小颗粒就是以后结晶的中心，称为晶核。以后结晶的中心，称为晶核。结晶的过程结晶的过程1. 形成过饱和溶液。形成过饱和溶液。2. 晶核的形成。晶核的形成。3. 晶体的生长。晶体的生长。 其中，溶液达到过饱和其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提，过饱和状态是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。度是结晶的推动力。二、结晶的过程二、结晶的过程 过饱和溶液的形成过饱和溶液的形成 （1）热饱和溶液冷却）热饱和溶液冷却 适合溶解度随着温度降低而显著减小的情况。适合溶解度随着温度降低而显著减小的情况。 （2）部分溶剂蒸发法）部分溶剂蒸发法 蒸发法是使溶液加压、常压或减

30、压下加热，蒸发蒸发法是使溶液加压、常压或减压下加热，蒸发除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。 （3）化学反应结晶法）化学反应结晶法 通过加入反应剂或调节通过加入反应剂或调节pH生成一个新的溶解度更低的物生成一个新的溶解度更低的物质，当其浓度超过它的溶解度时，就结晶析出。质，当其浓度超过它的溶解度时，就结晶析出。 （4）盐析法）盐析法2. 晶核的形成晶核的形成在工业结晶中，有在工业结晶中，有3种不同的起晶方法：种不同的起晶方法：一种是自然起晶法，即在一定温度下使溶液进入不稳定一种是自然起晶法，即在一定温度下使溶液进入不稳定区，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液进

31、入亚稳区，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液进入亚稳定区，溶质在晶核表面长大。定区，溶质在晶核表面长大。第二种是刺激起晶法，即将溶液蒸发进入亚稳定区后加第二种是刺激起晶法，即将溶液蒸发进入亚稳定区后加以冷却，使之进入不稳定区后产生一定的晶核，晶核析以冷却，使之进入不稳定区后产生一定的晶核，晶核析出后会使溶液浓度降低在进入亚稳定区，在亚稳定区内出后会使溶液浓度降低在进入亚稳定区，在亚稳定区内使晶体生长。使晶体生长。第三种是晶种起晶法，即将溶液蒸发或冷却至亚稳定区第三种是晶种起晶法，即将溶液蒸发或冷却至亚稳定区后投入一定数量和大小的晶种，使溶质在所加晶种表面后投入一定数量和大小的晶种，使溶质在所

32、加晶种表面长大。长大。3. 晶体的生长晶体的生长晶体生长：在过饱和溶液中已有晶核或加入晶种后，以晶体生长：在过饱和溶液中已有晶核或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶种或晶核将长大，这种现象称为过饱和度为推动力，晶种或晶核将长大，这种现象称为晶体生长。晶体生长。影响晶体生长的主要因素有：影响晶体生长的主要因素有： 杂质杂质 搅拌搅拌 温度温度 过饱和度过饱和度三、晶体质量控制三、晶体质量控制晶体的质量主要指晶体的大小、形状和纯度三个方面。晶体的质量主要指晶体的大小、形状和纯度三个方面。重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度的溶重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度的溶解度不同，将

33、晶体用合适的溶剂溶解，再次结晶，使其纯解度不同，将晶体用合适的溶剂溶解，再次结晶，使其纯度提高的操作。度提高的操作。四、结晶的应用四、结晶的应用工业结晶技术广泛应用于红霉素、四环素、制霉菌素工业结晶技术广泛应用于红霉素、四环素、制霉菌素等抗生素及谷氨酸、赖氨酸等氨基酸的纯化精制。等抗生素及谷氨酸、赖氨酸等氨基酸的纯化精制。第五节第五节 电泳电泳一、电泳原理与分类一、电泳原理与分类 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正

34、比，与该分子所携叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。子大小、极性、介质的粘度系数等）。电泳的类型电泳的类型电泳主要有区带电泳、等电点电泳和等速电泳等。二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分子结构大部分是由子结构大部分是由1,3联接的联接的-吡喃半乳糖，吡喃半乳糖，1，4联接的联接的3，6脱水脱水-D吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：吡喃半乳糖交替而成的，其结构为

35、： 在凝胶电泳中，一在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此染色，此时，核酸分子在紫时，核酸分子在紫外光下发出荧光，外光下发出荧光，肉眼能看到约肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带所形成的条带。染色：染色：电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置 v操作流程大致为：操作流程大致为： 凝胶的制备凝胶的制备胶板的制备胶板的制备加样加样电泳电泳观察和拍照。观察和拍照。操作步骤操作步骤v琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EBv凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶v样品的制备：样品样品

36、的制备：样品+1/5体积溴酚蓝体积溴酚蓝v加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）v电泳：电泳：5V/cmv观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相称量、加入缓冲液称量、加入缓冲液溶溶 胶胶准备胶槽准备胶槽凝胶冷却至凝胶冷却至50C，加，加EB至终浓度至终浓度0.5g/ml铺铺 胶胶凝胶凝固后取出梳子凝胶凝固后取出梳子加缓冲液加缓冲液准备样品准备样品点点 样样电电 泳泳注意观察溴酚蓝染液的迁移注意观察溴酚蓝染液的迁移紫外灯下观察电泳结果紫外灯下观察电泳结果照照 相相三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N-甲叉双丙

37、烯酰胺聚合甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由酰胺的单体形成长链，由N，N-甲叉双丙烯酰胺的双功能甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。 丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢，为中枢神经毒物。神经毒物。N，N-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液

38、与的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为为170mg/，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。触和吸入粉尘。 聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N，N-四甲基四甲基乙二铵（乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。从而加速聚合。 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制胶装置聚丙烯酰胺

39、凝胶制胶装置实验步骤实验步骤一、制胶一、制胶 1.1.配胶配胶 配胶应根据所测蛋配胶应根据所测蛋 白质相对分子质量范白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶围选择适宜的分离胶 浓度。由于浓度。由于SDS-PAGESDS-PAGE 有连续体系和不连续有连续体系和不连续 体系两种，两者各有体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法。有不同的配制方法。（以不连续体系为例）（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度10420%30%1104410415%20%4104110510%15%110551055%10%51052%5%试剂名称试剂名称配制配制20ml20ml不同浓度分离胶不同浓度分离胶所需各种试剂用量所需各种试剂用量/ml/ml配制配制10ml10ml浓缩胶浓缩胶所需试剂用量所需试剂用量5%5%7.5%7.5%10%10%15%15%3%3%分离胶贮液分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)30%Acr-0.8%Bis)3.333.335.005.006.666.6610.0010.00- -分离胶缓冲液分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HClpH8.8