酶与细胞的固定化

1、第五章第五章酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 酶应用过程中的一些不足固定化技术固定化技术 回收困难回收困难：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生

2、产。 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，可以反复，连续使用的酶。可以反复，连续使用的酶。优点：优点：1. 易于与产物、底物分离；可以进行连续反应，易于与产物、底物分离；可以进行连续反应，提高酶的使用率。提高酶的使用率。2. 提高酶的稳定性。提高酶的稳定性。 3. 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。 4. 酶反应过程能够加以严格控制。酶反应过程能够

3、加以严格控制。 5. 较游离酶更适宜于多酶反应。较游离酶更适宜于多酶反应。固定化酶的特点固定化酶的特点 从游离态变成牢固结合于载体的状态，酶从游离态变成牢固结合于载体的状态，酶分子所处的微环境发生了改变。分子所处的微环境发生了改变。问题：问题：1. 固定化可使酶的活性中心受损。固定化可使酶的活性中心受损。2. 空间位阻，影响底物和酶的接近。空间位阻，影响底物和酶的接近。3.只能用于可溶性底物，而且较适宜于小分子底只能用于可溶性底物，而且较适宜于小分子底 物，对大分子底物不适宜。物，对大分子底物不适宜。4. 增加了生产的成本。增加了生产的成本。 固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 G

4、rubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸氨基酸连续生产连续生产L-L-氨基酸氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。固定化酶的研究历史细胞固定化细胞固定化细胞的固定化细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在

5、一定是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。连续使用的活力。固定化细胞的优越性：固定化细胞的优越性：固定化细胞保留了胞内原有的多酶系统，既能以单一的酶，固定化细胞保留了胞内原有的多酶系统，既能以单一的酶，又以复合酶系完成整个反应过程。特别是需要辅助因子的合又以复合酶系完成整个反应过程。特别是需要辅助因子的合成过程，如合成干扰素等。成过程，如合成干扰素等。固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。稳

6、定。兼具游离细胞系完整的酶系统和酶固定化技术的优点。兼具游离细胞系完整的酶系统和酶固定化技术的优点。制备简单。制备简单。固定化细胞的局限性：固定化细胞的局限性：这种技术仅能用于产生胞内酶的菌体；这种技术仅能用于产生胞内酶的菌体；细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；固定化细胞不仅有固定化带来的扩散限制，而且还固定化细胞不仅有固定化带来的扩散限制，而且还增添了细胞膜、细胞壁的扩散限制作用；增添了细胞膜、细胞壁的扩散限制作用；由于微生物本身的复杂性，形成的固定化细胞一般由于微生物本身的复杂性，形成的固定化细胞一般在稳定性和酶活力水平上都比较低；在稳定性

7、和酶活力水平上都比较低；使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响产品质使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响产品质量；量；如果底物为高分子物质或不溶性物质，使用时就十如果底物为高分子物质或不溶性物质，使用时就十分麻烦。分麻烦。 固定化细胞类型： 生理状态固定化死细胞固定化死细胞：物理或化学处理，增加细胞膜的通透性或减少副反应，适合单酶催化反应。固定化增殖细胞固定化增殖细胞：在反应中保持旺盛的生长、繁殖能力。细胞和酶不断更新，酶处于天然环境中，稳定；保存了细胞全部酶活性，适宜多酶连续反应。固定化静止细胞固定化静止细胞：细胞处于休眠状态。 辅因子固定化辅因子无机辅因子无机辅因子有机辅因子有机辅因子辅

8、酶辅酶辅基：超滤辅基：超滤固定化酶的制备原则 根据不同酶的性质、不同的应用目的以及不同的应用环境：（1）保持自然酶的催化活性不破坏酶活性中心结构。（注意结合部位、和反应条件）（2）固定化的载体应该与酶结合牢固。（3）载体不能与反应液、产物发生化学反应。（4）有一定的机械强度，不会因搅拌破碎。（5）固定化后产生的空间位阻小。（6）成本低，利于工业化生产。5.1.3 酶和细胞的固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法物理吸附法物理吸附法 离子交换吸附法离子交换吸附法共价结合法共价结合法网格型网格型微囊型微囊型1. 物理吸附法物理吸附法利用氢键和疏水键等物理作用将酶固定在利用氢键和疏水键等物理作用将酶

9、固定在不溶性载体的固定化方法不溶性载体的固定化方法。 常用的固体吸附剂有无机载体无机载体（多孔陶瓷、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等）。有机载体有机载体（纤维素、胶原） 操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较弱结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 关键：关键：找到适当的载体，使其与酶之间的结合较为牢固。例如：N-烃基琼脂糖衍生物吸附黄嘌呤氧化酶和尿酶。ConA-葡聚糖，吸附糖蛋白。2. 离子结合法：离子结合法： 在适宜的在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具有离子交换基的

10、和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定方法。水不溶性载体的固定方法。操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏；操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏；吸附能力大于物理吸附。吸附能力大于物理吸附。缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受pH的影响。的影响。载体：DEAE-纤维素TEAE-纤维素DEAE-葡聚糖凝胶CM-纤维素关键：开发和选择合适的载体；对酶进行适当的化学修饰3. 共价键结合法共价键结合法通过共价键将酶的活性非必须侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固通过共价键将酶的活性

11、非必须侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定方法。定方法。载体：载体：天然高分子衍生物：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等天然高分子衍生物：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等人工合成高聚物：聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、尼龙等人工合成高聚物：聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、尼龙等无机载体：多孔玻璃、陶瓷等。无机载体：多孔玻璃、陶瓷等。条件：条件：亲水性和一定的机械强度亲水性和一定的机械强度 载体活化的方法：载体活化的方法： 载体上的偶联功能基团：芳香氨基、羟基、羧甲基和氨基 酶分子功能基团：氨基、酚羟基、咪唑基、巯基、酚基和羟基等。 重氮法：重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸

12、反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团。生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团。 迭氮法：迭氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物。迭氮化合物。 溴化氰法：溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶等，可以用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。等，可以用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。 烷化法：烷化法：含羟基的载体可以用均三氯三嗪等多卤代物含羟基的载体可以用均三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。优点优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，

13、不会轻易脱酶与载体结合牢固，稳定性好，不会轻易脱 落，可以连续使用。落，可以连续使用。缺点：反应条件苛刻，操作复杂，反应条件激烈，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件激烈，可能会破坏活性中心，催化效率低。可能会破坏活性中心，催化效率低。保护措施保护措施：1 1）选择适宜的固定方法和载体；）选择适宜的固定方法和载体；2 2）严）严格控制反应条件，提高反应的专一性；格控制反应条件，提高反应的专一性；3 3）应用可）应用可逆抑制剂或底物，封闭酶的活性中心。逆抑制剂或底物，封闭酶的活性中心。交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。双功能试剂：戊二醛已二胺顺丁稀二酸酐双

14、偶氮苯酶分子酶分子间交联键 交联反应可能发生在酶分子之间，也可能发生在分子内。 与酶的浓度与交联剂的浓度，也与pH和离子强度有关。 低酶浓度下主要形成分子内交联，保持溶解状态；高浓度下，分子间交联比例上升，变为不溶状态。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶网格包埋法：网格包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。常用的凝胶：常用的凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇及天然高分聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇及天然高分子化合物（淀粉、明胶

15、胶原等）。子化合物（淀粉、明胶胶原等）。凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化，而在细胞固定化中，凝胶包埋法是应用最的固定化，而在细胞固定化中，凝胶包埋法是应用最广的方法。主要是因为凝胶孔径要小于酶分子的直径。广的方法。主要是因为凝胶孔径要小于酶分子的直径。包埋法将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定方法。半透膜包埋法（微胶囊法）半透膜包埋法（微胶囊法）是将一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜内。是将一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜内。常用制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜

16、、火棉胶膜等。常用制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化，如：脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。如：脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。脂质体包埋法脂质体包埋法脂质体是指具有脂双层结构和一定包埋空间的微球体，它具有脂质体是指具有脂双层结构和一定包埋空间的微球体，它具有多层囊胞结构、单层小囊泡和单层大囊泡等三种类型。多层囊胞结构、单层小囊泡和单层大囊泡等三种类型。机械振动脂类溶液制成的脂质体。机械振动脂类溶液制成的脂质体。有一定机械性能、能定向将酶等被包裹物质携带到体内的特定有一定机械性能、能定向将

17、酶等被包裹物质携带到体内的特定部位，然后在那里将被包裹物质释放。在药用应用方面受到重部位，然后在那里将被包裹物质释放。在药用应用方面受到重视。视。特点：特点：1 1）不会与酶蛋白的氨基酸残基结合，很少改变酶的高级结构，）不会与酶蛋白的氨基酸残基结合，很少改变酶的高级结构，活力高。活力高。2 2）聚合过程中产生自由基，放热以及酶和试剂可能发生化学）聚合过程中产生自由基，放热以及酶和试剂可能发生化学反应。反应。3 3）只适用与作用小分子底物和产物的酶。）只适用与作用小分子底物和产物的酶。各种固定方法的特点比较各种固定方法的特点比较常用的细胞固定化的方法常用的细胞固定化的方法 (1)(1)直接固定法

18、直接固定法 直接固定法是指不使用载体，而借助物理、直接固定法是指不使用载体，而借助物理、化学方法将细胞直接固定。化学方法将细胞直接固定。比如对于微生物细胞，可比如对于微生物细胞，可以借助加热、冰冻或射线等物理手段进行固定化，也可应以借助加热、冰冻或射线等物理手段进行固定化，也可应用柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂和变性剂等化学处理来达用柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂和变性剂等化学处理来达到固定化。到固定化。这些处理的主要作用有：使菌体内起这些处理的主要作用有：使菌体内起破坏作用的蛋白酶等变性，以防止目的酶蛋白被破坏作用的蛋白酶等变性，以防止目的酶蛋白被其水解；使细胞结构固定，避免目的酶的泄漏；其水解；使

19、细胞结构固定，避免目的酶的泄漏；使菌体聚集，避免酶的流失，促进较大的菌体使菌体聚集，避免酶的流失，促进较大的菌体颗粒形成。颗粒形成。 直接固定法一般只能用于单酶或少数几种酶直接固定法一般只能用于单酶或少数几种酶催化的反应。催化的反应。 (2)(2)包埋法包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法是细胞固定化最常用的方法。 常用的包埋材料有常用的包埋材料有聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺、琼脂、海藻糖、琼脂、海藻糖、角叉角叉( (菜菜) )胶、胶原和纤维素等。胶、胶原和纤维素等。 角叉菜胶角叉菜胶的主要优点有：的主要优点有：操作简便，只需将菌体操作简便，只需将菌体的生理盐水悬液和溶于相同溶液的角叉菜胶混

20、合，冷却后即的生理盐水悬液和溶于相同溶液的角叉菜胶混合，冷却后即成，或在加入某些阳离子溶液后冷却即成；包埋条件温和，成，或在加入某些阳离子溶液后冷却即成；包埋条件温和，酶活力高；形成的凝胶有一定的机械强度，扩散限制小。酶活力高；形成的凝胶有一定的机械强度，扩散限制小。 包埋法固定的细胞与载体问没有束缚，固定化后具有较包埋法固定的细胞与载体问没有束缚，固定化后具有较高活力，可以固定活细胞。高活力，可以固定活细胞。 (3) (3)吸附法吸附法 吸附法是细胞固定化常用的另一类方法。可吸附法是细胞固定化常用的另一类方法。可用于菌体固定化的吸附剂很多。过去常用的吸附用于菌体固定化的吸附剂很多。过去常用的

21、吸附剂已为各种剂已为各种纤维素纤维素等取代，近年来等取代，近年来大孔陶瓷大孔陶瓷吸附吸附剂特别受到人们的注意。剂特别受到人们的注意。 吸附法制备固定化细胞的优点是条件温和、吸附法制备固定化细胞的优点是条件温和、方法简便、可再生。缺点是载体和细胞间吸附力方法简便、可再生。缺点是载体和细胞间吸附力弱，细胞容易脱落，特别是在底物相对分子质量弱，细胞容易脱落，特别是在底物相对分子质量高，介质的离子强度和高，介质的离子强度和pHpH变化的情况下更是如此。变化的情况下更是如此。 (4)(4)交联和共价偶联法交联和共价偶联法 交联试剂和共价偶联试剂对细胞的毒性较交联试剂和共价偶联试剂对细胞的毒性较大。要避免

22、这个缺点，反应要在尽可能温和的大。要避免这个缺点，反应要在尽可能温和的条件下进行，这些方法的发展有赖于新的温和条件下进行，这些方法的发展有赖于新的温和的功能试剂及偶联试剂的开发。的功能试剂及偶联试剂的开发。利用此法固定利用此法固定化的细胞在使用中由于细胞间、细胞和载体间化的细胞在使用中由于细胞间、细胞和载体间的键不易被底物或盐所破坏，所以其操作稳定的键不易被底物或盐所破坏，所以其操作稳定性较高。性较高。 交联法可以与包埋法结合使用，如用戊二交联法可以与包埋法结合使用，如用戊二醛和海藻酸等试剂进行双固定化等。醛和海藻酸等试剂进行双固定化等。辅酶物质的固定化方法辅酶物质的固定化方法 辅基的固定化辅

23、基的固定化 载体共价偶联法：琼脂糖，纤维素及高分载体共价偶联法：琼脂糖，纤维素及高分子载体等。子载体等。 辅酶的固定化辅酶的固定化 载体共价偶联：溴化氰载体共价偶联：溴化氰 辅酶的再生辅酶的再生 辅酶和酶共固定的反应系统辅酶和酶共固定的反应系统 辅酶与酶分子偶联形成辅酶辅酶与酶分子偶联形成辅酶-酶复合物的反应系酶复合物的反应系统统5.2 固定化酶和固定化细胞固定化酶和固定化细胞的性质与表征的性质与表征5.2.15.2.1固定化酶的性质固定化酶的性质活性：活性：多数情况下固定化酶活力常低于天然酶；有可能不影响；有时升高。稳定性稳定性: : 主要表现在对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定

24、性好，可以保存较长时间；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。最适温度：最适温度：固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。最适最适pHpH值：值：常会发生一些变化，主要受载体带电性质和酶催化反应产物性质的影响底物特异性：底物特异性：与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。 酶的活性 与酶的种类，反应系统的组成，固定化方法以及固定化载体的不同而变化。 影响酶催化活性的主要因素：影响酶催化活性的主要因素： 构象改变：固定化过程中酶和载体的相互作用，引起酶的活性中心/调节中心构象改变，从而导致酶活性改

25、变的一种效应。 立体屏蔽：由于载体的孔径太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心/调节中心造成了空间障碍，底物无法直接和酶接触，从而影响了酶活性的一种效应。（大孔径胶，连接臂） 微扰：固定化载体的亲水，疏水性质与介质的介电常数等直接或间接酶的催化能力。 分配效应：固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其他效应物在微观环境与宏观环境间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。（和固定化酶紧邻的微观局部环境） 扩散限制效应：指底物、产物以及其他效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。 稳定性稳定性: 较高的稳定性，较长的操作寿命和保存寿命。较高

26、的稳定性，较长的操作寿命和保存寿命。 主要表现在:1）酶的耐热性增加（提高反应温度，加快反应速度）2）对变性剂，抑制剂的抵抗能力增强（在有机溶剂中进行反应）3）减轻了蛋白酶的破坏作用4）增强储存稳定性和操作稳定性（半衰期）热、pH化学物质载体活性位可溶性酶变性酶固定化酶固定化对酶稳定性的影响有规则卷曲多肽随机分散多肽固定化增加了酶活性构象的牢固程度，防止酶分子伸展变形。 最适温度：最适温度：固定化酶的最适作用温度一般比游离酶提高。 最适最适pH值：值：常会发生一些变化，主要受载体带电性质的影响。（负电荷载体，其最适pH上升）载体性质对酶反应最适pH的影响 底物特异性：底物特异性：与游离酶比较可

27、能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。 酶的动力学特征酶的动力学特征：表观米氏常数随载体的带电性能变化，受溶液中离子强度影响大。（异种电荷在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液的高，Km降低）。固定化对酶底物特异性的影响5.2.3 固定化酶（细胞）的评价指标固定化酶（细胞）的评价指标 1. 酶酶/细胞的活力细胞的活力 一定条件下由它催化的某一反应初速度来表示。一定条件下由它催化的某一反应初速度来表示。（每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量）（每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量） 间歇测定：间歇测定：在搅拌或震荡反应器中，与溶液酶同样测定条件下进行，间隔一定时间取样，过滤后按常规酶活测定

28、方法。 连续测定：连续测定：将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。 2. 蛋白总量蛋白总量 检测固定化的酶蛋白的量双辛可宁酸法（BCA法）考马斯亮蓝法 3. 偶联率及相对活力偶联率及相对活力 4. 半衰期半衰期 在连续测定的条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间。5.3 固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-