基因打靶(精美)

1、基因打靶QQ:947645776目录一、简介 二、什么是基因打靶三、优点四、基因打靶的原理五、基因打靶步骤六、基因打靶技术的应用 一、简介： 在历经近20年的推广和应用后, 基因打靶技术终于获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。 2007年10月8日, 美国科学家卡佩奇和史密斯、英国科学家埃文斯因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因打靶技术的发明和应用革命性地改变了现代生物医学研究的面貌, 并导致了生物医学研究各个领域中的许多突破性进展。 三巨人 卡佩奇在哈佛时就是一位成果丰富的研究者，他发现了导致蛋白合成的分子机制。当他于1973

2、年在犹他大学建立实验室时，便试图将分子基因学引入到对动物细胞的研究，以便获悉如何掌控这些细胞里的基因。卡佩奇于1977年开始一系列实验室研究，这些研究展现了对动物细胞进行基因打靶的技术，并在1989年成功对一只老鼠进行基因打靶。 Mario R. Capecchi 史密斯1925年出生在英国，后获得美国国籍。史密斯1951年获得牛津大学生物化学博史密斯和卡佩基几乎同时对“基因靶向”技术做出了奠基性贡献。他目前的研究方向主要集中在两个方面：一是对异形基因进行修正，另外一个便是利用人类基因病变构造动物模型，以发现新的疾病治疗方法。多年来，奥利弗-史密西斯教授及其助手深入研究了“基因打靶”的具体操作

3、方法，并借助这项技术治疗地中海贫血症。 Oliver Smithies 埃文斯1941年出生在英国，1963年从剑桥大学毕业后，进入伦敦大学学院学习，获得解剖学和胚胎学博士学位。1978年，他返回剑桥大学工作。3年后，他和同事从小鼠胚胎中第一次成功分离出未分化的胚胎干细胞。这为“基因靶向”技术提供了施展本领的空间。如今，埃文斯在英国加的夫大学担任哺乳动物遗传学教授。 Sir Martin J. Evans基因打靶（gene targeting）是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。建立在胚胎干细胞（embryonic stem

4、cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。 三、优点： 基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；基因打靶能把外源基因引入染色体DNA 的特定片段上；在设计合理的情况下基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造;基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA 的复制而稳定复制。 进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要导人靶细胞的靶载体(targeting vector)。该载体不仅含有需要插入的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段即同源重组指导序列。将此载体用基因转移的方法导人靶细胞通过外源载体和

5、内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组(homologous recombination，HR)，使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上。 生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。 同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。1.1. 重组基因载体的构

6、建重组基因载体的构建2. 2. 转化受体细胞转化受体细胞3.3. 筛选筛选4.4. 鉴定鉴定1.1.重组基因载体的构建重组基因载体的构建把目的基因和同源重组指导序列重组到带有标记基因的载体上。基因同源重组的发生依赖于同源序列的长度，目前认为3O40bp的同源序列长度将是发生同源重组的保险线，重组率与同源序列长度呈正比，一般情况下同源重组指导序列为基因组DNA而不用cDNA，以免造成基因组缺失或其他改变。基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等。 基因打靶载体类型：基因插入型载体(Gene-insertion vector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的

7、酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。基因置换型载体(Genereplacement vector)：置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。进行基因打靶。 2.2.转化受体细胞转化受体细胞外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、逆转录病毒法、DNA-磷酸钙共沉淀法等。目前应用最广的是显微注射法。 显微注射每次只能注射一个细胞； 电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使

8、1的ES细胞稳定转染； 逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。 正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)。 构建载体时，在靶基因的同源区序列中插入正选择标记，在同原序列的3和5两个末端接上负选择标记。同源重组时，只有载体的同源区以内以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。 正选择基因多为新霉素抗性基因（neo）基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达 负选择基因常用单纯孢疹病毒的胸腺尿嘧啶激酶基因（H

9、SV-tk），在靶基因同源区之外在靶基因同源区之外，位于载体的3末端， 以药物G148和GANG（丙氧鸟苷）作双重选择。neo 基因的产物使细胞具有G 418抗性而HSV一tk， 基因的产物则使内氧鸟苷变成毒性核苷酸从而致死。用G418筛选所有能表达neo 基因的细胞然后用GANG淘汰所有H5 一旗f 常表达的细胞剩下的细胞为命中的细胞。无毒的丙氧鸟苷（GANC） 毒性核苷酸 杀死细胞 腺苷激酶蛋白4.鉴定观察被击中细胞的生物学特性并进行分子生物学检测。可以用特异PCR方法鉴定，PCR 引物一端以基因组DNA 的特定基因座为模板，另一端以导人的外源基因为模板这样保证扩增后的片段为同源重组产生的

10、特殊片段。对经PCR鉴定的克隆用Southern杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆。 六、基因打靶技术的应用基因打靶技术与小鼠胚胎干细胞技术结合，产生了近千种转基因小鼠品系对于大动物的胚胎干细胞还没有成功的报道，但已成功的用培养的体细胞进行基因打靶。PPI 公司的研究人员在原代绵羊和猪细胞中进行了基因打靶并通过体细胞核移植，获得了带有目的基因的克隆羊。基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。Park JM等人对拟南芥ADL1基因进行了基因敲除。Ruf S等对烟草进行基因打靶发现了一个新的与光系统I相关的基 。 基因打靶技术在微生物领域有广泛的应用。在80年代利用酵母35S rDNA 作为同源序列将外源基因捅入到酵母rDNA 区，使外源基因得到稳定表达。在随后的研究中人们利用酵母的rDNA作为同源序列构建了一系列高转化效率、高拷贝插入及高度表达的打靶载体。在寄生虫学的研究中也应用了基因打靶技术，利用此技术制备利什曼原虫的减毒活虫疫苗已进入临床前期研究。 基因打靶技术是近十余年发展起来的分子生物学技术。它克服了随机整合的