生物制药基本技术

1、内容提要内容提要概述概述各种提取与纯化技术各种提取与纯化技术小结小结Chapter 6 Basic Technique For Biopharmaco 生物制药是把生物体内的具有生物活性的基生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质，保持原来的结构和功能，又能在含有多本物质，保持原来的结构和功能，又能在含有多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来。它种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来。它是一项严格、细致、复杂的工艺过程，涉及物理、是一项严格、细致、复杂的工艺过程，涉及物理、化学、生物学、工程等方面的知识和操作技术。化学、生物学、工程等方面的知识和操作技术。 对于一个新研制的生物药物，从查

2、阅文献开对于一个新研制的生物药物，从查阅文献开始，到探索实验、条件考察（记录客观），还要始，到探索实验、条件考察（记录客观），还要总结制定工艺规程、制定分析鉴定方法，再进行总结制定工艺规程、制定分析鉴定方法，再进行中试放大，全面考察工艺是否成熟，是否稳定等中试放大，全面考察工艺是否成熟，是否稳定等过程。过程。问题：问题：1、标准化方法？、标准化方法？ 2、如何发现或研制新药？、如何发现或研制新药？概概 述述1. 基本制药技术和方法基本制药技术和方法种类种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒、噬菌体和动植物病毒。1）提取法）提取法(Extraction)2）发酵法（）发酵法（ Zymotechni

3、cs）3）化学合成（）化学合成（Chemical synthesize）4）组织培养法（）组织培养法（Tissue culture）5）现代生物技术）现代生物技术(Modern Biotechnics): Gene engineering, Enzyme engineering, Cell engineering , protein Engineering,1）原料的选择和预处理原料的选择和预处理2）原料的粉碎）原料的粉碎3）提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制）提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工过程。成粗品的工过程。4）纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸）纯化：粗制品经盐析、有

4、机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。骤进行精制的工艺过程。5）浓缩、干燥及保存）浓缩、干燥及保存6）制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片）制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。剂型。Raw Material Selecting and Pretreatment1、原料选择的基本准则、原料选择的基本准则 1）在大量的信息资料和在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。实践经验的基础上，选择目标原料。2）选择有效成选择有效成

5、分含量高的新鲜材料；分含量高的新鲜材料；3）来源丰富易得；来源丰富易得；4）制造工制造工艺简单易行；艺简单易行；5）成本比较低；成本比较低；6）原料的采集不破坏原料的采集不破坏生态环境生态环境, 选择对环境友好的原材料资，防止生物入选择对环境友好的原材料资，防止生物入侵。侵。2、预处理方法、预处理方法 1）动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。 2）冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存

6、，冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。以便抑制微生物和酶的作用。 3）有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。和脱脂，有利于贮存。Comminution of Raw Materialu原料的粉碎原料的粉碎：在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。分释放到溶液中，有利于提取或吸附。微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨

7、、超声、加压等处理方法。超声、加压等处理方法。动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：常用磨碎法；植物肉质组织：常用磨碎法； 1. 1. 机械法：机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。u冷热交替法：冷热交替法：将材料投入沸水中，在将材料投入沸水中，在90左右维持左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。此法多用于细菌

8、或病毒中提取蛋白和细胞被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。核酸。u反复冻融法反复冻融法：把待破碎的样品冷至把待破碎的样品冷至-20-15 ，使使之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物性细胞及细胞内的颗粒可以破碎动物性细胞及细胞内的颗粒可以破碎。u超声波处理法超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用时，常用50100mg/L菌体浓度，在菌体浓度，在110KC频率下频率下处理处理1015min。操作时注意避

9、免溶液中气泡的存。操作时注意避免溶液中气泡的存在。在。u加压破碎法：加压破碎法：加气压或水压，达加气压或水压，达0.5934.32 MPa (210350kgf/cm2)的压力时，的压力时， 可使可使90%以上细胞被以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。A.A.自溶法自溶法 将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下,利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏,使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度,动物材料在0-4,微生物在室温下。自溶时,需加少量的防腐剂,甲苯、氯仿,以防止外界细菌的污染。由于自溶时间较长,不易控制,故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少

10、用。C.C.表面活性剂处理法表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中,兼有亲脂性和亲水性基团,能降低水的界面张力,具有乳化、分散、增溶作用。B.B.溶菌酶处理法溶菌酶处理法 溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物,对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时,采用pH8.0的0.1mol/L Tris-0.01mol/LEDTA制成2亿/ml的细胞悬液,然后加入100g1mg的溶菌酶,在37C保温10min,细菌胞壁即被破坏。u常用有:SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。1 1、提取条件的选择提取条件的选择 1）溶剂:常用水/稀盐/稀酸/稀碱,有机溶剂如乙醇/

11、丙酮/氯仿/四氯化碳/丁醇等。丁醇提取的pH、温度范围较广(pH3-6, 20-40)。适用于动植物和微生物原料。 2）pH:与溶解度和稳定性有很大关系,一般选择在pI的两侧 3）温度:一般在5 以下,但对温度耐受力较大的药物,可适当的提高温度,使杂蛋白变性分离,有利于提取和纯化。如胃蛋白酶/酵母醇脱氢酶及多肽激素类,选择37-50 提取,效果较好。u提取：提取：也称抽提、萃取,就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度,从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固体处理（液固萃取）和液体处理（液液萃取）。2 2、影响提取的因素影响提取的因素 1）被提取物质溶解度的大小,一般极性对极性；非极性对非极性

12、；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。2）扩散作用的影响,扩散方程式G=DF*C/X*t3）分配作用的影响,分配定律(C1/C2)恒温、恒压=K 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中,溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下,溶解度随着盐浓度升高而增加,称盐溶作用；当盐浓度不断升高时,不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀,称盐析作用。u优点：设备和条件要求低,安全应用范围广泛。在高盐情况下蛋白质不易发生变化,一般在室温下操作。缺点：分级分离能力不高。硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等等u 盐析时应注意的几个问题：1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同

13、,盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求,正确计算饱和度。2）pH 值的选择:蛋白质在pI时的溶解度最小。因此,进行盐析时的pH,要选择在被分离蛋白质的pI 附近。3）蛋白质浓度：在相同条件下,蛋白质浓度越大越易沉淀,使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高,其他蛋白质共沉作用也愈强,这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度,可避免共沉的干扰。4）温度：一般在室温下进行,浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的,要在低温下进行。常在0-4 范围内迅速操作。如尿激酶。5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后,经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析,时间一般较长,应常换透析液,注意防止污辱。 利用不同蛋白

14、质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解,与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数,使其溶解度变小.同时,还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。 几种溶剂的介电常数几种溶剂的介电常数溶剂名称溶剂名称 20 时的介时的介电常数电常数溶剂名称溶剂名称20 时的时的介电常数介电常数乙醚乙醚4.33甲醇甲醇33丙酮丙酮21.4水水80乙醇乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液甘氨酸水溶液 137介电常数与静电力的关系：介电常数与静电力的关系： F=Q1Q2/Kr2。式中：。式中： K介电介电常数。指带相反电荷的微粒之间的静电引力。常数。指带相反电荷的微粒之间的静电

15、引力。F相距为相距为r的的2个带电量分别为个带电量分别为Q1、Q2点电荷相互作用的静电引力。点电荷相互作用的静电引力。 经验：如30-40%乙醇沉淀的物质,改用丙酮时,其体积分数可减少10%左右。即可用2030%的丙酮;而70-80%乙醇沉淀的物质,可用5060%的丙酮即可。 注:水有较高的介电常数,具有很好的溶剂性能,是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强,沉淀也好过滤,易干燥,但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。有机沉淀法应注意的问题有机沉淀法应注意的问题（1）控制工艺过程的温度:整个操作过程应在低温下进行,而且最好是同一温度。（2）防止溶剂局部浓度过高:

16、加入有机溶剂时搅拌要均匀,速度要适当,避免局部浓度过高,引起沉淀物的破坏、变性或失活。（3）及时处理沉淀物:沉淀物经过滤或离心后,要立即用水或缓冲液溶解,降低有机溶剂的浓度。（4）pH的选择：在待沉淀蛋白质的pI附近。（5）有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素,尤其是对敏感酶类。 利用蛋白质在等电点时的溶解度最低,而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。由于各种蛋白质在等电点时,仍有一定的溶解度而沉淀不完全,多数蛋白质的等电点又都十分接近,所以单独使用效果不理想,分辨力差,多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。 膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔

17、过滤、气体渗析和超精密过滤。根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压的驱动下,能通过超滤膜的分离粒子的范围,一般在0.0010.01m。n超滤即利用一种特制的膜对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤。 优点：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。以高分子透过性薄膜为分离介质,在超过溶液渗透压力的情况下,使溶液中的溶剂透过薄膜,同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反,即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。 特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。由高分子材料制成的薄

18、膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在0.2-10 m。n 以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为0.010.2 m。用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。5 5、离子交换层析、离子交换层析 采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂,分离纯化各种生化物质。离子交换树脂在水中能溶胀,溶胀后,其分子中的极性基团（活性基团）,具有可扩散的离子,能与溶液中的离子起交换作用;非极性基团作为树脂的骨架,使树脂不溶于水并具有网状结构,为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和

19、力等物理化学过程。(1)强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，pH一般没有限制。(2)弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，pH愈大交换能力愈强。(3)强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。pH没有限制。(4)弱酸性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交换能力愈大。（1）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。（2）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。（3）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达到一定浓度后交换速度不在升高。（4）离子的水化半径:水化半径小的易被吸

20、附。（5）树脂酸碱性的强弱和溶液的pH。（6）交联度大小:交联度愈小,树脂愈易膨胀,交换速度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。（7）有机溶剂的影响:当有有机溶剂存在时,会降低树脂对有机离子的选择性,而容易吸附无机离子。6 6、凝胶层析、凝胶层析 指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。1)优缺点 缺点:分离速度慢。优点:设备简单,操作方便,分离效果好,回收率高,分离条件缓和,不使活性物质失活变性,凝胶可重复使用,无需再生处理。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。2)几种

21、常用的凝胶：基本骨架是16糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为Sephadex葡聚糖凝胶,珠状颗粒物,化学性质稳定,不溶于水/弱酸/碱和盐溶液。低温时,在0.1mol/L 盐酸中保持1-2h不改变性质;室温时,在0.01mol/L 盐酸中放置半年也不改变;在0.25mol/L的氢氧化钠中, 60两个月没有发改变。可在120加热30min灭菌而不破坏,但高于120即变黄。湿状贮存易发霉,若长期不用,需加防腐剂。（由碳碳骨架构成。完全为惰性。稳定性比葡聚糖凝胶好,洗脱时不会有凝胶物质下来。缺点：不耐酸。遇酸时酰胺键会水解为羧基,使凝胶带有一定的离子交换基团。:天然凝胶

22、,不是共价交联,是以氢键交联。空隙度以契纸糖的浓度来改变,化学稳定性不如葡聚糖凝胶。没有干凝胶，必须在溶胀状态保存,遇脱水剂、冷冻和一些有机溶剂即破坏,丙酮和乙醇对它无影响。在pH4.5-9,温度0-40稳定。对硼酸有吸附,不能用硼酸缓冲液。他能分离及万到几千万相对分子质量的物质,弥补了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶的不足。瑞典商品名Sepharose,美国称生物凝胶A（Bio-Gel-A）,英国称Sagavac。常用的为聚甲基丙烯酸酯（Polymethacrylate）凝胶、聚苯乙烯凝胶（如Styrogel,Bio-Beads-S）生物活性物质都有亲和作用,如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间,多

23、糖与蛋白质复合体。n 亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基,与配基结合的层析介质称为载体。n亲和层析能从粗提液中,通过一次简便处理,便可得到高纯度的活性物质,既可分离一些生物材料中含量极微的物质,又能分离一些性质十分相似的物质。1)1)优缺点优缺点 优点:设备要求不高,操作简便,适用范围广,特异性强,分离速度快,效果好,条件温和。缺点：通用性较差,洗脱条件要求苛刻。自然界中数量最大的大分子生物材料,取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差,不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷,非特异性吸附较强,加上空间位阻等原因,其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用

24、于分离与核酸有关的物质。如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA. 市售商品有:无定型微纤维/微晶纤维素/珠状纤维素。用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。琼脂糖的质量浓度为20g/L(2%)、40g/L(4%)、60g/L(6%)几种，相应的商品称为Sepharose 2B、4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。这类载体能使吸附物质保持活性,能迅速活化并接上各种功能基团,结构疏松孔径大,流速快。与琼脂糖凝胶相比孔径太小,特别是经配基偶联后,凝胶膨胀度会进一步边小,所以应用受到限制。：碳碳骨架,有丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,具有网

25、状三维空间结构。商品名为Biogel P。避免接触强氧化剂,配基偶联后会使它的网格缩小,在一定程度上限制了它的应用。化学和物理稳定性好,机械强度高,不但能抵御酶及微生物的作用,还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。 缺点:亲水性不强,对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附,而且可供连接的化学活性基团也少。 改良方法:为了克服其缺点,市售Bio-Glass的商品都已事先连接了氨烷基（烷基胺）。A)用葡聚糖包被玻璃珠,则可改善其亲水性,并增加化学活性基团。B)用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。 由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成的载体

26、,商品名为Ultrogels ACA。它的特点是载体上既有羟基又有酰胺基,并且都能与配基单独作用。但不能接触强碱,以免酰胺水解,使用温度不超过40C。在丙烯酰胺和琼脂糖的混合胶中加入7%的四氧化三铁,则可制得一种称为磁性胶（Magnogels ACA44）的载体。 当悬浮液中含有不均匀粒子时,依靠磁性能将载体与其他粒子分离。磁性胶载体常用于酶的免疫测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、免疫吸收剂和细胞分离等的微量测定和制备。（1）配基浓度；（2）空间障碍；（3）配基与载体的结合位点；（4）载体的孔径；（5）微环境（化学因素）。浓缩：浓缩：低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程。常在提取后和结晶

27、前进行,有时也贯穿与整个制药过程。蒸发装置的设计原理蒸发装置的设计原理: :加热/扩大液体表面积/低压。薄膜蒸发浓缩Film evaporation concentration,卧式喷淋降膜蒸发器/Rose蒸发器/板式蒸发器;减压蒸发浓缩Decompression evaporation concentration 减压抽真空(真空浓缩),适用不耐热的药物和制品。吸收浓缩(Absorbing concentration) 通过吸收剂直接吸收除去溶液中的溶剂分子使溶液浓缩的方法。吸收剂与溶液不起化学反应,对生化药物不起吸附作用,易与溶液分开。吸附剂除去溶剂后可重复使用。常用的吸收剂：聚乙二醇、聚

28、乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝胶。凝胶可直接投入待浓缩的溶液中,溶剂和小分子被吸收到凝胶内,大分子留在溶液中,然后离心过滤。使用聚乙二醇时,先将溶液装入半透膜的袋内,扎紧袋口,外加聚乙二醇覆盖,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇吸去。 结晶：结晶：利用某些药物具有形成晶体的性质是目标药物（溶质）呈晶态从溶液中析出的过程。 结晶的条件：结晶的条件：（1）纯度purity：各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶。 蛋白质和酶，纯度不低于50%。总趋势是越纯越易结晶，但已结晶的制品不表示达到了绝对的纯化，只能说到了相当纯的程度。有时纯度不高，但加入有机溶剂和制成盐，也能达到结晶。（2）浓度considerat

29、ion 结晶液的浓度要较高,以利于分子间的碰撞聚合。但浓度过高,相应杂质和溶液黏度增大,反而不利于结晶,或生成纯度较差的粉末结晶。（3）pH 选择pH在pI附近,有利于晶体析出。（4）温度temperature 通常在低温条件进行,活性物质不易变性,又可避免细菌繁殖。（5）时间Time 结晶的生成和生长需要时间。但生物药物要求在几小时内完成,时间不宜过长。（6）晶种Crystal seed 不易结晶的药物常加晶种。 干燥：干燥：是从湿的固体生物药物中,除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。它也是一种蒸发,但不同于浓缩。通常包括原料药的干燥和制成的临床制剂的干燥。（1 1）常压干燥）

30、常压干燥Normal press desiccationNormal press desiccation：通风与加热结合。成本低干燥量大。但时间长，易污染。（2 2）减压干燥）减压干燥Decompression desiccationDecompression desiccation：利用专用设备减压加速，使溶剂迅速蒸发。（4 4）冷冻干燥）冷冻干燥 Freezing desiccationFreezing desiccation：在低温(-60 -10)及高真空6.67-40Pa(0.05-0.3mmHg)下,将物料与溶液中的水分直接升华的干燥方法。适用于高度热敏的生物药物。制剂应具有多孔性

31、、疏松、易溶的特点,一般含水量在1%-3%。设备投资及维护费用高,生产能力不大。 优点:快速高效,可在无菌条件下操作.应用广泛。 缺点:热利用率不高,设备费用投资大。减压干燥时间短，温度低。制药常用方法。 （3 3）喷雾干燥）喷雾干燥Spray desiccationSpray desiccation: :将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的热气流中,迅速蒸发干燥的方法。从理论推算:每升液体,如果喷成10m直径的雾滴,约有1.91*1012多个,表面积有600m2。实验表明:把含水量为80%的1L溶液,喷成直径约10-60 m雾滴,当与热空气接触时,仅3-5s可使雾滴水分气化而得到干燥产

32、品。 改进的干燥设备;环型喷射干燥器;振动流动干燥器;涡流干燥器。n 灭菌：指杀灭或除去一切微生物的操作技术。1）干热空气灭菌：通常在烘箱里利用热空气杀灭微生物,在100,1h可杀死繁殖的细菌。某些细菌在一定情况下可以变成芽孢,有较强的耐热力,一般需160-170灭菌1h以上或140灭菌3h以上。 灭菌的时间应自全部进行灭菌的物品达到灭菌温度时算起。待灭菌物品的温度常落后于烘箱室的温度，特别是导热性能差或装量大的待灭菌物品。要确保灭菌完全,应测定温度延后时间,将延后的时间考虑到规定的灭菌时间内。 湿热灭菌湿热灭菌：常压灭菌,即在常压下用100 流通蒸汽或在水内煮沸来杀灭细菌。 减压灭菌：在热压

33、灭菌器中，用超过101.325kPa的饱和蒸汽杀灭细菌。n 热压灭菌所需温度、相对压力和时间： 115.5 1.7 kgf/cm2 (表压0.7 kgf/cm2 ）30min 121.5 2.0 kgf/cm2 (表压1.0 kgf/cm2 ）20min 126.5 2.4 kgf/cm2 (表压1.4 kgf/cm2 ）15min 紫外线灭紫外线灭菌 主要用于空气和物体的表面灭菌。一般紫外灯高度距操作台面不超过1.5m，被灭菌物距灯与台面的垂直点中心不超过1.5 m。用于室内空气灭菌时，约6-15m3的空间装一盏紫外灯。人体若照射紫外线过久会产生眼结膜炎、红斑和皮肤变红等。故一般均在操作前照

34、射1-2h。若操作时必须照射时，对操作人员的眼睛和皮肤要加以防护。 过滤灭菌过滤灭菌 通过适宜的滤器除去药液中所含的细菌.常用有硅藻土滤柱、素瓷滤柱、垂熔玻璃滤器、石棉板吕器和微孔滤膜（纤维素酯膜、聚碳酸酯膜）。滤器孔径约为0.2m时,灭菌结果才可靠。适用于不耐热的药物溶液的灭菌、除去活菌和死菌。灭菌后的药液进行分装时,要特别注意防止染菌,应进行无菌操作。 化学灭菌化学灭菌 用化学药品抑制或杀灭细菌的方法。常用其气体或蒸汽杀灭细菌的药品有甲醛、丙二醇、乳酸等,适用于无菌室的空气灭菌。 生物制药是利用一定的生物制备技术从生物材料中获取特殊的生物活性物质的过程。需注意几个问题：1.生物材料的组成成

35、分复杂,各种化合物的形状/大小/相对分子质量和理化性质都各不相同,有些还属于未知.且这些化合物在分离时仍在不断的代谢之中。 2.有些化合物含量很低或极微。制备时,原材料用量很大，得到产品很少。 3.生物活性物质,一旦离开了生物体内环境,很易变性。 4.分离制备的过程几乎在溶液中进行,各种温度、PH、离子强度等参数,对溶液中各种组成的综合影响,常常无法固定,有些实验或工艺设计的合理性不强,常带有很大的经验成分。因此,要建立重复性好的成熟工艺,对生物材料、各种试剂及其辅料都要加以严格规定。 5.生物药物“均一性”证明与化学药物的“纯度”是不同的。结构与功能（活性）的关系？无标记的蛋白质无标记的蛋白

36、质- -纯化程序纯化程序组氨酸标记的蛋白质组氨酸标记的蛋白质纯化程序纯化程序第七章第七章 生物制药产业发展趋生物制药产业发展趋势与希望势与希望 生物制药产业作为21世纪最具希望和发展潜力的新兴高技术产业，不仅对国民经济的发展产生巨大的拉动作用，并且为人类的疾病防治带来更多、更安全、更有效、甚至难以替代的手段。“珍惜生命和关注健康”是人类永恒的主题，因此生物制药产业将永远是“朝阳产业”。 一一. .哺乳动物细胞表达的生物技术药物所占比重越哺乳动物细胞表达的生物技术药物所占比重越来越大来越大 生物制药的发展初期都是表达一些分子量较小、结构简单的蛋白质,如胰岛素、干扰素或集落刺激因子,氨基酸残基都在

37、200aa以下,一般只有12对二硫键甚至没有二硫键,因此用大肠杆菌表达既经济有简便。生物制药的发展趋势是从细胞因子等激动剂为主的产品,转变为以拮抗作用为主的新生物技术药物,如天然IL-1拮抗剂、中和作用的单抗如Remicade、TNF-拮抗剂受体-Fc融合蛋白Enbrel,-1-蛋白水解酶抑制剂、抑制HIV-1与CD4+细胞融合的Pro-542等。 越来越多的分子量大、结构复杂的功能性蛋白得到开发,如抗体和酶,都是分子量在50200kDa的糖蛋白。 由于这些蛋白结构复杂,二硫键多,并且翻译后的修饰如糖基化对蛋白活性的影响很大,采用原核表达系统往往不能满足蛋白表达的需要。采用哺乳动物细胞表达既能

38、保证重组蛋白质二硫键的正确配对和蛋白质折叠、又能保证蛋白质的糖基化,即用哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上都高度一致。 从2000年以后FDA批准的生物技术药物来看,哺乳动物细胞表达系统更受到FDA和各大制药公司的重视。我国生物制药与欧美国家的主要差距就是哺乳动物细胞表达的产品极少。 从销售情况看，哺乳动物细胞表达的产品也已占据主要地位，年销售额超过20亿美元的6个生物技术药物均是哺乳动物细胞表达的产品，而销售额位于前10位的生物技术药物，有8个产品为哺乳动物细胞表达的产品。 随着近年来越来越多的哺乳动物细胞表达的生物技术药物获准上市，到2007年预计动物细胞表达的产品市场份额

39、将占70%75%。在中国的生物制药产业中，已批准上市的动物细胞表达产品只有促红细胞生成素 (EPO)和乙肝疫苗，尽管这两种产品的使用剂量都在g级水平，但是这两种产品的生产能力都很小，动物细胞大规模培养技术已成为生物技术药物生产最关键和最具挑战性的技术。 由于抗体分子与靶标抗原具有高度特异的亲和力，抗体类药物在治疗过程中表现出专一性强、毒副作用小等特点，成为各大制药公司研究开发的热点领域。鼠源单抗在临床试验中疗效很不理想，存在以下缺点：缺点：（1）半寿期很短，只有3040小时，远小于完整人源抗体的半寿期(1021天)，在人体中易被清除。（2）人体免疫细胞Fc()受体结合鼠IgG的Fc段的能力很差

40、,不能有效引发抗体依赖性介导的细胞毒(ADCC)效应和补体依赖性细胞毒效应(CDC),即不能发挥抗体的生物学功能。（3）反复使用鼠源单抗会产生人抗鼠抗体(HAMA),HAMA反应可以有效快速地破坏这种鼠源单抗,并且HAMA反应可能会引发严重的过敏反应。 鼠源抗体人源化技术的出现,大大促进了治疗性抗体药物的开发,人源化技术包括嵌合抗体(chimeric antibody,60%70%人源化)制备技术和人源化抗体(90%95%人源化)制备技术,用这些技术制备的抗体克服了鼠源抗体的缺点,使得治疗性抗体成为目前最大的一类生物技术药物。 世纪90年代中期,FDA批准了多种抗体类药物,如嵌合抗体Remic

41、ade、Rituxan、ReoPro,人源化抗体如Herceptin、Synagis等。 应用噬菌体显示人抗体库技术和转基因小鼠Xeno- Mouse技术可以制备人源抗体,这些技术又为治疗性抗体药物的研发提供了新技术方法。 2002年FDA批准的用于类风湿关节炎类风湿关节炎治疗的单抗HUMIRA,就是使用噬菌体显示技术构建的人源抗体,标志着治疗性抗体的研究与开发又上了一个新台阶。 2004年,FDA已批准了17种治疗性抗体,2种受体-Fc融合蛋白(抗体样分子),这些药物在治疗肿瘤、类风湿关节炎和Crohns病(克罗恩氏病,节段性回肠炎)、抗器官移植排斥,防治病毒感染,抗血小板凝聚等方面表现出非

42、常理想的疗效。目前抗体类药物的销售额已占整个生物技术药物市场的1/5,而到2008年,抗体类药物的年销售额将达到200亿美元,占生物技术药物市场的1/3。尽管抗体类药物的发展如火如荼,但我国抗体药物的研发却举步为艰,其根本原因是我国上游构建和下游生产,尤其是动物细胞大规模培养技术的落后。三、分子量大、结构复杂的蛋白质的生产三、分子量大、结构复杂的蛋白质的生产 许多遗传性疾病如血友病、溶酶体贮积病、肺囊性纤维化等都是难于治愈危及生命的疾病,其病因都是基因突变等导致体内缺乏某种生理活动（代谢过程）所需要的酶。 酶都是分子量大、结构非常复杂的蛋白质,在基因工程时代到来之前,有的只能通过从人体血液或组

43、织中提取才能获得,不仅来源有限,而且易传播传染性疾病,如治疗血友病的凝血因子。还有一些非遗传性疾病,由于某些蛋白的分泌不足导致疾病,如不孕症。或者提高某些蛋白（酶）的浓度可以缓解或治愈某些疾病,如治疗心梗的TNK-tPA、治疗脓毒症的蛋白C或治疗高尿酸症的Rasburicase尿酸酶。随着真核表达系统的日臻成熟,以及大规模动物细胞培养技术的进步,FDA近年来批准了多种高分子量的复杂蛋白药物。 能挽救生命并且没有其它替代药物的生物技术药物有着极好的市场表现。例如,全球戈谢病病人只有50006000,而用Cerezyme治疗的病例达到3800,每1例病人1年的药费需要170000美元,1998年销

44、售额达到4.7亿美元,2001年为5.7亿美元,位列当年生物技术销售额的第10位,2007年可达9.48亿美元。又如2003年4月批准上市的治疗法布莱氏病的Fabrazyme,当年的销售额便达到0.57亿美元,到2007年的销售额可达3.97亿美元。而凝血因子 NovoSeven和促滤泡素Gonal-F的年销售额都超过4亿美元。表3所列产品绝大多数是哺乳动物细胞表达的产品,除了TNK-tPA正在申请临床外,表中所列产品我国目前还不具备开发能力,更遑论生产能力。四、四、 PEG化以改善产品性能化以改善产品性能 对原产品的化学修饰，尤其是对原产品的化学修饰，尤其是PEG化以改善产品的化以改善产品的

45、性能，是近年来生物技术药物发展的新趋势。性能，是近年来生物技术药物发展的新趋势。 最近几年FDA几乎没有批准一个新的细胞因子类药物,但是却批准了几个PEG化的细胞因子产品(见表4)uPEG化指将聚乙二醇(PEG)分子通过化学交联共价结合到多肽或蛋白质药物上,有以下优点:1）极大延长了药物半寿期;2）降低了某些药物的免疫原性;3）增强药物活性;4）降低药物毒性;5）血浆的药物浓度波动小,可提高疗效;6）可减少给药次数;7）可改变药物作用机制。l90年代批准的PEG-L-天冬酰胺酶和PEG化酰苷脱氨酶都不是基因重组蛋白,而基因重组的干扰素和G-CSF,其PEG化的产品由于其更好的疗效,在市场中都比

46、原产品表现更好。 由于PEG化干扰素的血浆浓度波动小,其抗病毒能力远好于未PEG化干扰素,如治疗丙肝的疗效从24%28%提高至50%68%,因此两种PEG化的干扰素-PEGASYS和VIRAFERON PEG的销售情况远好于原代产品,并有逐渐替代原产品的趋势。 利用基因工程技术,对已有蛋白质药物进行改造,以获得性能更好的产品,也是今些年生物技术药物发展的趋势,这明显表现在胰岛素、EPO和t-PA突变体药物研究与开发方面。 Amgen公司利用定点突变技术开发的第二代EPO产品Aranesp,与第一代EPO相比,N-糖链从3条增加至5条,分子量从30kDa增加到37kDa，其半寿期延长了3倍,因而

47、给药方式从23次/周改为1次/周,虽然2001年9月才获准上市,但该药品的年销售额已达到20亿美元,排位第五。 一般速效、中效、长效和双重胰岛素都是通过剂型的改变以改变胰岛素的吸收,其生物活性成分都是重组人胰岛素。 如2002年10月欧洲共同体授权Novo Nordisk公司7个抗糖尿病药物重组胰岛素（rDNA）的更新换代产品:长效Insulatard、双重作用Mintard、长效作用Montard、长效作用Protaphane、非常长效Ultratard、快速作用Velosulin、速效作用Actrapid等。 通过定点突变技术构建胰岛素突变体如速效胰岛素Humalog,Novolog和长效

48、胰岛素Lantus则是改变胰岛素分子结构以改变药物吸收速度或药代动力学，从而起到速效或长效的作用。 Humalog就是将胰岛素B链的Pro28Lys29突变为Lys28Pro29,而Novolog则是将B链的Pro28突变为Asp28。 胰岛素突变体Humalog、Novolog在皮下注射后具有吸收快、起效快、作用时间短和餐后尖峰状的生理学分泌相似的特点,用药更灵活方便。 Lantus是将胰岛素A链的Asn21突变为Gly21,在B链末端增加了Arg31 Arg32两个氨基酸,使其成为第一个真正长效药物,恒定的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）时间至少持续24h,和相对恒定基线胰岛素生理水

49、平相似。 近25年来,一系列新技术的出现改变了药品开发的状况,带来了前景和希望。这些技术包括基因工程、合理药物设计、组合化学、有效筛分以及现在出现的基因组技术。 专家们认为,药品研制的失败率仍然居高不下,由此造成的损失占了研制成本的很大部分。研制过程早期的候选药物约每5000种才有1种进入市场,进入临床试验的药物每5种才有1种能进入市场。其余的药物则被淘汰掉,因为有的不产生疗效,有的则有毒性。n制药公司通常在开始时要确定出研制目标,目标常常是人体中的一种被认为对某种疾病起作用的蛋白质。然后设计出或找到一种能够依附于目标蛋白质的化合物,由此来改变疾病发展过程。弄清这种化合物在其它方面是否合适,比

50、如说是否可以做成药丸。然后在动物身上做毒性试验,在此之后方可在人身上做试验。 1)利用蛋白质工程技术开发新产品; 2)采用新的高效表达系统，利用动物细胞，特别是整体动物大量表达基因工程医药产品; 3)将基因组研究成果转化为生物技术新药; 4)开发新剂型的生物技术药物。 人类基因组测序工作完成，对人的健康与疾病起因有更深入的认识。尽管第一张人类基因组测序工作草图尚未弄清所有人类基因的功能。但是这些基因产物（即活性蛋白质）被表达出来，将会有几千种甚至更多具有特殊疗效的蛋白药物的诞生。因此，基因工程药物具有很大的增长空间和发展前景。 1303004500200400600亿美元19982001200

51、6年全球生物技术药品销售额全球生物技术药品销售额增长情况增长情况18303000100200300亿元199019972005年中国生物技术药品市场情况中国生物技术药品市场情况当前全球生物技术药品分布当前全球生物技术药品分布北美6 3 %其他5%欧洲2 5 %日本7 %现状和前景现状和前景 据据2002年资料显示，年资料显示，至今世界上已取得的生至今世界上已取得的生物技术研究成果中，物技术研究成果中，70%以上为医药工业生以上为医药工业生物技术产品。物技术产品。生物药品名称生物药品名称适应性适应性年销售额年销售额(亿美元亿美元)抗CD3MAb移植排斥0.80DNase囊性纤维变性1.11EPO

52、贫血16.50因子血友病2.50G-CSF嗜中性白细胞减少症9.36葡萄糖脑苷酯酶Gaucher氏病2.15 GM-CSF骨髓移植0.41GPb/aMAb血管造形术中血凝块1.30B型肝炎疫苗B型肝炎10.00人生长激素生长不良，肾功能不全4.50人胰岛素糖尿糖7.00人白细胞介素-2肾癌0.40-干扰素癌症，肝炎7.00-干扰素多发性硬化2.55-干扰素肉芽肿病0.04tPA心力衰竭/栓塞/中风3.00总计68.6216种生物技术药物销售情况种生物技术药物销售情况 我国已批准生产的生物技术药物和疫苗我国已批准生产的生物技术药物和疫苗 名称名称 作作 用用rhu IFN1b (外用) 病毒性角

53、膜炎rhu IFN1b 乙肝、丙肝rhu IFN2a 乙肝、丙肝、疱疹等rhu IFN2a (酵母) 乙肝、丙肝rhu IFN2b 乙肝、丙肝白血病等rhu IFN2a (栓剂) 妇科病rhu IFN2b (凝胶剂) 疱疹等rhu IFN 类风湿rhu EGF(外用) 烧伤、创伤EGF 衍生物 烧伤、创伤rhu IL2 癌症辅助治疗rhu IL2 125Ser 癌症辅助治疗上海华晨rhu GCSF 刺激产生白细胞rhu GMCSF 刺激产生白细胞、骨髓移植rhu EPO 产生红细胞rhu GH 矮小病bFGF(外用) 创伤、烧伤RSK 溶血栓(心梗) 抗IL28 单 抗乳膏剂 银屑病人胰岛素

54、糖尿病乙肝疫苗乙肝疫苗 预防乙肝预防乙肝痢疾疫苗 预防痢疾第二节第二节 新型生物药物研制的理论和新型生物药物研制的理论和方法方法新型生物药物新型生物药物是指利用是指利用生物体或生物过程生物体或生物过程产产生的生的结构新颖结构新颖的药物。的药物。结构新颖结构新颖是指与以前是指与以前药物有着不同的化学结构，是药物有着不同的化学结构，是种新的化学种新的化学实体实体(New chemical entity(New chemical entity，简称，简称NCE)NCE)。这。这类新型生物药物国家认定为一类新药。国际类新型生物药物国家认定为一类新药。国际上所说的新药开发就是指开发上所说的新药开发就是指

55、开发NCENCE药物。根药物。根据据NCENCE来源进行生物药物分类。来源进行生物药物分类。一类是一类是利用重组利用重组DNADNA技术技术，向大肠杆菌、酵，向大肠杆菌、酵母、动物、植物细胞中导入目的基因，母、动物、植物细胞中导入目的基因，构建构建重组细胞重组细胞，生产目的基因编码的蛋白质类、，生产目的基因编码的蛋白质类、多肽类药物或疫苗，或将一些特殊基因及基多肽类药物或疫苗，或将一些特殊基因及基因片段导入宿主细胞后使宿主细胞产生原来因片段导入宿主细胞后使宿主细胞产生原来不能产生的蛋白质，获得新功能，或阻遏宿不能产生的蛋白质，获得新功能，或阻遏宿主细胞基因的复制、转录、翻译等，抑制其主细胞基因

56、的复制、转录、翻译等，抑制其功能，甚至杀死宿主细胞，即功能，甚至杀死宿主细胞，即。另一类是另一类是利用微生物、动植物细胞或酶生产利用微生物、动植物细胞或酶生产的非上述药品，通过的非上述药品，通过筛选筛选可获得这类新药的可获得这类新药的NCENCE的的先异物先异物(Lead compound)(Lead compound)。这类药物种。这类药物种类繁多，包括传统的利用发酵工程生产的药类繁多，包括传统的利用发酵工程生产的药物和直接从动植物中提取的天然药品等。物和直接从动植物中提取的天然药品等。(1) (1) 确定研究计划确定研究计划 要综合考虑医疗、市场、要综合考虑医疗、市场、化学的评估化学的评估

57、, ,文献状况文献状况, ,专利的检索专利的检索, ,结构的选结构的选择，合成的前景等因素。择，合成的前景等因素。(2) (2) 准备化合物准备化合物 文献研究文献研究, ,合成或分离合成或分离, ,结构结构鉴定鉴定, ,标准化标准化, ,专利申请专利申请, ,对研究目标的复核等。对研究目标的复核等。以上两个环节需占用以上两个环节需占用l l2 2年的时间，需准备年的时间，需准备6000600080008000个化合物供筛选。个化合物供筛选。(3) (3) 药理筛选药理筛选。(4) (4) 化学试验化学试验 活性成分的分析。活性成分的分析。(5) (5) 临床前临床前期期(Preclinica

58、l I) (Preclinical I) 进一步药进一步药理研究包括毒性理研究包括毒性(2(2种动物种动物) )及活性成分的稳及活性成分的稳定性。定性。(6) (6) 临床前临床前期期(Preclinical ) (Preclinical ) 进一步药进一步药理研究包括亚急性毒性理研究包括亚急性毒性(2(2种动物种动物) )、畸胎学、畸胎学研究、药物动力学、动物体内的吸收和排泄、研究、药物动力学、动物体内的吸收和排泄、剂型的研究与开发、包装与保存期的研究。剂型的研究与开发、包装与保存期的研究。以上几个环节占用以上几个环节占用2 23 3年的时间，化合物分年的时间，化合物分别剩下大约别剩下大约2

59、020个以下或更少。个以下或更少。(10) (10) 注册申请上市注册申请上市 经政府药政部门批准后经政府药政部门批准后提供治疗应用。这一过程需提供治疗应用。这一过程需2 23 3年。年。(11) (11) 售后监测售后监测(Post(Postmarketing marketing surveillance) surveillance) 据情况进行药理试验、毒性据情况进行药理试验、毒性试验、特殊试验和药物动力学试验；对副作试验、特殊试验和药物动力学试验；对副作用的报告进行收集、评价和鉴别；对药品生用的报告进行收集、评价和鉴别；对药品生产进行质量控制，制剂的生产和包装。产进行质量控制，制剂的生产

60、和包装。一个新药的问世要提供一个新药的问世要提供6000600080008000个化学物个化学物质。经历质。经历9 91313年的时间，耗资约年的时间，耗资约2.32.3亿美元。亿美元。系统性从纵的方面看主要是若干个环节紧密系统性从纵的方面看主要是若干个环节紧密的衔接和重叠，横的方向主要表现为多种学的衔接和重叠，横的方向主要表现为多种学科相互之间的渗透性和协同性。科相互之间的渗透性和协同性。在整个新药的研究和开发中，先导化合物的在整个新药的研究和开发中，先导化合物的发现是决定以后研究与开发的首要因素，要发现是决定以后研究与开发的首要因素，要找到一个好的先导化合物，需要建立好的找到一个好的先导化