核酸化学课件

1、第二章 核 酸 (Nucleic Acid) 主要介绍碱基、核苷、核苷酸和核酸的结构、性质和功能，核酸的分离、提纯、鉴定等。一 核酸的概念 核酸英文名nucleic acid（NA） 1868年瑞士F. Miescher（米歇尔）发现了核酸。第一节第一节 核酸的概念和及生物学意义核酸的概念和及生物学意义 核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的大分子化合物。 核蛋白 磷酸 核苷 碱基 戊糖 蛋白质 核酸核苷酸 二二 核酸的分类、分布和生物学功能核酸的分类、分布和生物学功能 核酸分为两大类核酸分为两大类. .n脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNADNA） Deoxyribonu

2、cleic AcidDeoxyribonucleic Acidn核糖核酸（核糖核酸（RNARNA） Ribonucleic AcidRibonucleic Acid。nDNADNA分子含有生物物分子含有生物物种的所有遗传信息，种的所有遗传信息，分子量一般都很大。分子量一般都很大。nDNADNA为双链分子，其为双链分子，其中大多数是链状结中大多数是链状结构大分子，也有少构大分子，也有少部分呈环状结构。部分呈环状结构。脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNADNA）DNA 双链线状双链线状 双链环状双链环状 单链线状：动物病毒单链线状：动物病毒MVM 单链环状：噬菌体单链环状：噬菌体X174 真核细胞染

3、色体真核细胞染色体DNA 噬菌体噬菌体T2，T5，T7，P22 E-Coli染色体染色体DNA 线粒体线粒体DNA 叶绿体叶绿体DNA 多瘤病毒多瘤病毒DNA，病毒，病毒SV40DNA 噬菌体噬菌体和和X174的复制型的复制型 DNA的生物功能 DNA是主要的遗传物质基因：基因：是指在染色体上占有一定位置的遗传单位。基因有三个基本属性三个基本属性：可通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；经转录对表型有一定的效应；可突变形成各种等位基因。DNA具有基因的所有属性，基因也就是DNA的一个片段。1944年Avery细菌转化实验 转化作用：转化作用的物质称转化因子 从一种细菌中得到DNA通过一定途径进

4、入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。 噬菌体感染实验 1952年美国Hershey 噬菌体感染实验 DNA与遗传性疾病、癌变的关系（1）镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变（2）白化病的基因缺失（3）癌变核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）nRNARNA主要是负责主要是负责DNADNA遗传信息的遗传信息的翻译和表翻译和表达达，分子量要比，分子量要比DNADNA小得多。小得多。RNARNA为单链为单链分子。分子。RNARNA的类别的类别n根据根据RNARNA的功能，可以分为的功能，可以分为mRNAmRNA、tRNAtRNA和和rRNArRNA三种。三种。其它类别的其它类别的RNA （1）病毒）病

5、毒RNA（Viral RNA, rRNA） （2）核内）核内RNA（nuclear RNA, nRNA） 不均一核不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA） 小分子核小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA） 小分子核仁小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA） 染色体染色体RNA（chromosomal RNA, ch RNA） （3）线粒体）线粒体RNA（mitochondrial RNA, mit RNA） （4）叶绿体）叶绿体RNA（chloroplast RNA, chlRNA或或ctR

6、NA） mRNA (mRNA (信使信使RNA)RNA)n约占总约占总RNARNA的的5%5%。n不同细胞的不同细胞的mRNAmRNA的链长和分子量差异很大。的链长和分子量差异很大。n它的功能是将它的功能是将DNADNA的遗传信息传递到蛋白质合的遗传信息传递到蛋白质合成基地成基地 核糖核蛋白体。核糖核蛋白体。Messenger RNA5-帽子 5-非密码区 密码区3-非密码区 polyA tRNA (tRNA (转移转移RNA)RNA)n约占总约占总RNARNA的的10-15%10-15%。n它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋

7、息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。白体的作用。n已知每一个氨基酸至少有一个相应的已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNAtRNA。nRNARNA分子的大小很相似，链长一般在分子的大小很相似，链长一般在73-73-7878个核苷酸之间。个核苷酸之间。lTransfer RNATransfer RNArRNA (rRNA (核糖体核糖体RNA)RNA)n约占全部约占全部RNARNA的的80%80%，n是核糖核蛋白体的主要组成部分。是核糖核蛋白体的主要组成部分。nrRNA rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。的功能与蛋白质生物合成相关。Ribosome RNARibosome RNA原

8、核生物核糖体 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34种蛋白质16S rRNA21种蛋白质真核生物核糖体 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49种蛋白质18SrRNA33种蛋白质RNA的生物功能 1RNA与蛋白质的生物合成 （1）mRNA与遗传密码 （2）tRNA的作用 接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。 （3）rRNA的作用 具有核酶活性，能够催化肽键形成，起装配和催化作用第二节第二节 核酸的组成核酸的组成 一一 碱基（碱基（base）：又称含氮碱）：又称含氮碱 （1）嘧啶碱（pyri

9、midine, Py） （2）嘌呤碱（purine, Pu） 其它嘌呤（核酸的代谢产物）：黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸等 （3）修饰碱基（）修饰碱基（modified base）：）： 也称稀有碱基（也称稀有碱基（minor base） （一）核苷（nucleoside） 1核苷的结构 核苷：含N苷，-苷 OHOH2CHHHbaseHOHOH二、核苷、核苷酸核苷中戊糖与碱基的连接方式：核苷中戊糖与碱基的连接方式： OHOH2CHHHHOHOHNNNNNH291 腺嘌呤核苷 （adenosine）胞嘧啶脱氧核苷 （deoxycytidne）OHOH2CHHHHOHHN1NONH21OCH2HHOHHO

10、HHNNONH2HOsyn-CytidineOCH2HHOHHOHHNNNH2HOanti-CytidineOOCH2HHOHHOHHHOsyn-AdenosineNNNNNH2OCH2HHOHHOHHHOanti-AdenosineNNNNNH2核苷核苷 核糖核苷（核苷）：核糖核苷（核苷）：A、G、C、U 脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：dA、dG、dC、dT 命名，简写符号命名，简写符号 天然核苷：一般为反式构象天然核苷：一般为反式构象 2修饰核苷（modified nucleoside）： 也称稀有核苷（minor nucleoside） 修饰核苷包括三种情况: （1

11、）由修饰碱基和糖组成的核苷 （2）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷 （3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷 （1）HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)（2）OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲基腺苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR（3）OCH2HHOHHOHHHO (pseudouridine)HNNHOO51假尿嘧啶核苷()修饰核苷的简写符号 少数修饰核苷用单字符号如D、I；但大多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。 m N22取代位置核苷取代基的数目取代基取代

12、基用下列小写英文字母表示 :甲基m 乙酰基ac 氨基n 甲硫基ms 羟基o或h 硫基s 异戊烯基i 羧基c 注意：注意：例例: 2-O-甲基腺苷甲基腺苷 Am 含修饰核糖的核苷即含修饰核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，在甲基核苷的表示方法，在核苷符号的右下方注上一个小写核苷符号的右下方注上一个小写m。（二）核苷酸（nucleotide, Nt） 1核苷酸的结构 （1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）： 2，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2 -AMP)(3 -AMP)(5 -AMP)3，5一脱氧核糖核苷酸一脱氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3- monphosph

13、ate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)（2）脱氧（核糖）核苷酸（）脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：）：（三）核苷酸的衍生物（三）核苷酸的衍生物 ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。它的结构如下：物。它的结构如下：O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)ATPATP的性质的性质nATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。nATP 是生物体内最重

14、要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。cAMP cAMP 和和 cGMPcGMPncAMP(3,5- 环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP( 3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。胞内 ATP cAMP + PPi 磷酸二酯酶 5-AMP 腺苷酸环化酶 （AC）O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)（一）DNA的一级结构 1DNA分子中核苷酸的连接方式分子中核苷酸的连接方式 第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构包括包括DNA的结构、的结构、RNA的结构的结构。

15、 RNAPP5335PP53P53ACGT简写方法：线条式、文字式简写方法：线条式、文字式 n在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化为：为：n 5PAPCPGPCPTPGPTPA 3n 或5 ACGCTGTA 3n在DNA一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即DNA互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成RNA后可形成“发夹”样结构，有调控意义。n GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT n CGAT CAAGT

16、GAG ACTTG TTAA 1提出DNA双螺旋结构模型的根据 （2）x-光衍射分析 （二）DNA的二级结构 （1）已知核酸化学结构和核苷酸键长键角的数据（3）DNA碱基组成的定量分析碱基组成的定量分析 20世纪世纪40年代年代chargaff规则规则 DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。 A=T；G=C；A+G=T+C ；A+C=T+G ； 2DNA双螺旋结构模型（双螺旋结构模型（double-helical structure） 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA双螺旋结构。双螺旋结构。 DNA双螺旋结构要

17、点： 1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。（某些病毒的DNA是单链分子ssDNA）2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3螺距为3.4 nm，含10个碱基对（bp），相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5DNA构象有多态性。稳定DNA双螺旋结构的化学键 （1）互补碱基对之间的氢键 （

18、2）碱基堆积力（base-stacking forces）：碱基有规律的堆积，使碱基之间发生缔合，形成了碱基堆积力，由碱基的电子之间的碱基相互作用而产生的。（3）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键生理pH条件下DNA带有大量的负电荷，吸引着各种阳离子，组蛋白、Na+、K+ 、Mg2+ 等，形成了离子键，消除了自身因带负电荷而产生的斥力，增加了DNA的稳定性。3DNA双螺旋的种类 Watson Crick DNA双螺旋结构（B型DNA） 当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时， DNA的构象发生改变。 不同DNA纤维的空间结构 类型结晶状态ANa盐，相对湿度75%时结晶BNa盐，

19、相对湿度92%时结晶C锂盐，相对湿度66%时结晶A-DNA： 与B-DNA相同处：与B-DNA不同点 :（1）螺体宽而短，直径2.55nm；11个核苷酸一圈，螺距2.46nm。 （2）碱基的倾角大一些：倾角19。 A-DNA：RNA分子中的双螺旋区；DNA-RNA杂交分子。 A-DNA和B-DNA之间可以相互转换，推测在转录时，DNA分子发生BA的转变。 反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。4DNA双螺旋的研究进展 （1）Z-DNA 1979年美国ARich等人发现了左旋DNA（左手DNA双螺旋结构）Z-DNA特点：n两条多核苷酸绕成一个左手螺旋；n糖磷酸骨架链的走向呈“Z”字形，因此被称为Z-D

20、NA；n分子外表只有一道沟槽（大沟消失,小沟加深）；n碱基对在分子轴外侧，并构成分子的凸面；nDNA双螺旋体比较细长。概括：A型螺旋比较粗短，碱基倾角大一些，大沟深度明显超过小沟；B型比较适中；Z型细长，大沟平坦，核苷酸构象顺反相间，使磷酸和糖骨架呈Z字形。nDNA二级结构还存在三股螺旋DNA，三股螺旋DNA中通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合，第三股的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对。n三股螺旋中的第三股可以来自分子间，也可以来自分子内。n三股螺旋DNA存在于基因调控区和其他重要区域，因此具有重要生理意义。（2）三螺旋

21、）三螺旋DNA （2）三螺旋）三螺旋DNA nA（T）*A T;G（C）*G CnH-DNA（三）DNA的三级结构DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。生物体内有些DNA是以双链环状DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌体DNA，细菌染色体与细菌中质粒DNA，真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA都是环状的。环状DNA分子可以是共价闭合环，即环上没有缺口，也可以是缺口环，环上有一个或多个缺口。在DNA双螺旋结构基础上，共价闭合环DNA（covalentlyclose circular DNA）可以进一步扭曲形成超螺旋形（super helical form）。根据螺旋的方

22、向可分为正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加，而负超螺旋可以减少双螺旋的圈数。几乎所有天然DNA中都存在负超螺旋结构。n一段双螺旋圈数为10的B-DNA连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形DNA（双螺旋的圈数=链绕数，即T=L，超螺旋数W=0；L=T+WL=T+W），但将这一线形DNA的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形DNA存在的扭曲张力，可导致双链环形成负超螺旋（T10，L=9，W = -1）。nL为连环数；T为扭转数；W为超螺旋数。nL=T+WL=T+Wn比连环差： (L-L0)/L0n在生物体内，绝大多数超螺旋DNA以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦

23、超螺旋解开，则会形成解链环形DNA，有利于DNA复制或转录。n螺旋具有相同的结构，但L值不同的分子称为拓扑异构体拓扑异构体。DNA拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。L值必定是整数。 （四）真核生物染色体n真核细胞DNA是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。DNA被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠：核小体、30nm纤丝和放射环。n核小体是染色体的基本结构单位，是DNA包装的第一步，它由DNA结合到组蛋白上形成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠”状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有5种，H2A、H2B、H3和

24、H4各两分子组成的八聚体是核小体核心颗粒，DNA缠绕其上，相邻核小体间的DNA称为连接DNA且结合H1。压缩比约为7 。n30nm纤丝是第二级压缩，每圈含6个核小体，压缩比是6。 n 30nm螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是40。n再进一步形成染色单体，总压缩近一万倍。典型人体细胞的DNA理论长度应是180 cm，被包装在46个5m的染色体中。 nRNA通常以单链形式存在，比DNA分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA链可以回折且通过A与U，G与C配对形成局部的双螺旋，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构。 nRNA的C2位羟基是游离的，是一个易发生不良反应

25、的位置，它使RNA的化学性质不如DNA稳定，能较DNA产生更多的修饰组分。RNA的种类、大小、结构都比DNA多样化，按照功能的不同和结构的特点，RNA主要分为tRNA、rRNA和mRNA三类。n此外，细胞的不同部位还存在着另一些小分子RNA，如核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞质小RNA（scRNA）等，分别参与mRNA的前体（hnRNA）和rRNA的转运和加工过程。RNA的结构几类RNA的结构 （1） tRNA的结构：分子量最小的RNA，约占总RNA的15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中，起着转运氨基酸的作用。 1965年Holley等测定了酵母丙氨酸tRNA的

26、一级结构，并提出二级结构模型。 1.一级结构特点：核苷酸残基数在7395；含有较多的稀有碱基（如mG、DHU等）；5-末端多为pG，3- 末端都是-CCA。2tRNA的二级结构为“三叶草”形，包括4个螺旋区、3个环及一个附加叉。各部分的结构都和它的功能有关。5端17位与近3端6772位形成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄”，3端有共同的-CCA-OH结构，用于连接该RNA转运的氨基酸。3个环是二氢尿嘧啶环（D环）、反密码子环、TC环。319731975年S.H.Kim的X射线衍射分析表明，tRNA的三级结构呈倒L字母形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端tRNA的二级结构 （1）aa接受臂（a

27、mino acid arm） （2）二氢尿嘧啶环 （dihydrouridine loop, DHU loop） （3）反密码环（anticodon loop） （4）额外环（extra loop） （5）TC环（TC loop） 1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。 近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。 n1约占细胞总RNA的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所。n2核糖体在结构上可分离为大小两个亚基。原核细胞的rRNA有3种，23S与5S rRNA在大亚基，16S在小亚基。真核细胞有4种r

28、RNA，其中大亚基含28S、5.8S、5S，小亚基只有18S。n3. 各种rRNA的一级结构中的核苷酸残基数及其顺序都不相同，且有特定的二级结构。rRNA的结构 n原核生物的mRNA特点：n原核生物以操纵子作为转录单位，产生多顺反子mRNA，即一条mRNA链上有多个编码区，5和3 端各有一段非翻译区（UTR），无修饰碱基。（3）mRNA的一级结构 真核生物mRNA的一级结构可用下式表示 :5-帽子 5-非密码区 密码区3-非密码区 polyA 5-cap：m7G(5)pppNmp 5-cap cap0: m7G(5)pppNp cap1: m7G(5)pppNmpNp cap2: m7G(5)

29、pppNmpNmpNp 5-cap的功能 (1) 防止mRNA被核酸酶降解。(2) 为mRNA翻译活性所必需。(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。polyA的功能 (1) 保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。nDNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。n并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解，其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。n在很低pH条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。n在高pH时，RNA的磷酸酯键易被水

30、解，而DNA的磷酸酯键不易被水解。第四节第四节 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解酸碱水解酸碱水解OHRNA-水解OHOH2CHHHbaseHOOPOHO2-核苷酸3-核苷酸 混合物包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。 （一）核酸水解酶的分类 1底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase） 2作用方式：核酸内切酶（endonuclease）3按磷酸二酯键断裂的方式 4其它：如双链酶、单链酶等 核酸外切酶（exonuclease）（二）核糖核酸酶类 1牛胰核糖核酸酶（pancreatic

31、 ribonuclease, 简称RNase A或RNase I） 2核糖核酸酶T1（ribonuclease T1，简称RNase T1） 3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2） 主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC PPPPPPPAUCGAG（三）脱氧核糖核酸酶 1牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I） PPPPPPPP2牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II） PPPPPPPPP3限制性内切酶（restriction endonuclea

32、se） 简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。（1）限制性内切酶的特征）限制性内切酶的特征 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 粘性未端，平末端粘性未端，平末端 （2）限制性内切酶的命名 EcoRI 属名（第一个字母）、种名（前两个字母）、菌株、编号属名（第一个字母）、种名（前两个字母）、菌株、编号 （3）限制性内切酶举例）限制性内切酶举例 （1）一般物理性质：）一般物理性质： DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。 （2）两性解离：碱基

33、（嘌呤、嘧啶化合物杂环中的）两性解离：碱基（嘌呤、嘧啶化合物杂环中的N） 磷酸的解离磷酸的解离 DNA的酸碱变性使酸碱滴定曲线不可逆的酸碱变性使酸碱滴定曲线不可逆二二、核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质（3）紫外吸收性质胞嘧啶核苷酸的解离胞嘧啶核苷酸的解离 OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa2=4.5-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOOCMPpKa3=6.4-pI =CMPpKa1+pKa22=0.8+4.52= 2.65OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa1=0.80H+-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHHOCMP

34、+H+核苷酸的两性解离和等电点核苷酸的两性解离和等电点 碱基的紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。 紫外分光光度法紫外分光光度法 首先根据首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度的比值判断核酸样品的纯度纯纯DNA：A260/A280=1.8 纯纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）比值明显降低）纯的核酸样品可根据纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量若若260nm光吸收值为光吸收值为

35、1相当于相当于50g/ml双螺旋双螺旋DNA或相当于或相当于40g/ml单链单链DNA或或RNA或相当于或相当于20g/ml寡核苷酸。寡核苷酸。摩尔磷消光系数（摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法）法 A：样品的光吸收值：样品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩尔数：每升溶液中磷的摩尔数 L：光径：光径 L CA)p(8)磷的原子量(30.9每升中磷的重量C( (g g) )W W LLLWA98.3098.30WACA)p( 在在pH7.0时；时；DNA的的 为为6600, RNA的的 为为77007800。 )p( )p( ：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数：摩尔磷消光系

36、数，也称摩尔磷吸光系数 )p( 知道了磷的含量就可知核酸的含量知道了磷的含量就可知核酸的含量增色效应与减色效应增色效应与减色效应 增色效应（hyperchromic effect）：核苷酸以及单链多核苷酸的 值比双螺旋结构的多核苷酸的 值要高，所以核酸发生变性时， 升高，此现象称为增色效应。减色效应（hypochromic effect）：DNA复性后， 又 降低，这种现象称减色效应)p( )p( )p( )p( （四）核酸的变性、复性和杂交 1变性（denaturation） 核酸变性的概念 引起核酸变性的因素 （1）热变性 结构：螺旋线团 理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度 生物活性：生物活

37、性或丧失 （2）熔点（Tm） Tm: 熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度 DNA热变性过程中，紫外吸收值增高，有一个特征性曲线称熔解曲线，通常将熔解曲线的中点，即紫外吸收值达到最大值50%时的温度称为解链温度解链温度，又叫熔点（T Tm m）。 （3）影响）影响Tm值的因素值的因素 DNA的均一性的均一性 DNA中中G-C对的含量对的含量 经验式经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 盐离子强度盐离子强度2复性（renaturation） （1）复性 理化性质: 比旋光度 粘度)p( 高于Tm值5 复性 也称退火 缓缓慢慢冷冷却却迅迅速速冷冷却却生物活性得到部分恢复 （2）影响复

38、性的因素 DNA的浓度 DNA片段的大小 温度 DNA的组成特点21CC0 Cot : 21时的时的Cot值，即指复性完成一半时的值，即指复性完成一半时的Cot值。值。 C0：t=0时，起始DNA的浓度（mol/L）C：t时间时，单链DNA的浓度（mol/L） 复性快慢由 来表示。Cot : 213杂交（杂交（hybridization） 核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过 碱基互补形成双螺旋结构。碱基互补形成双螺旋结构。 单链单链DNA与单链与单链DNA杂交（杂交（DNA-DNA）利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。利用核酸

39、杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。单链单链DNA与单链与单链RNA杂交（杂交（DNA-RNA）单链单链RNA与单链与单链RNA杂交（杂交（RNA-RNA）用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交 1975年英国年英国E. M. Southern首创的首创的Southern blotting（Southern印迹）印迹）原理原理方法方法探针：作为检测用的已知探针：作为检测用的已知DNA序列或序列或RNA序列的片段序列的片段 1977年G.K.Stark首创Northern blotting （Northern印迹） Western blotting（Western

40、 印迹） 第五节第五节 核酸的分离、纯化和核苷酸的制备核酸的分离、纯化和核苷酸的制备 （一）核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :1保持低温（04）。 2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等

41、RNase的抑制剂。 （二）大分子DNA的提取 1材料的选择 2细胞破碎 1.机械法：根据固体剪切作用分：珠磨法，压榨法 根据液体剪切作用分：高压匀浆法，超声破碎法 2.非机械法：干燥法 溶胞作用：酶溶解法，化学渗透法，物理法（渗透压法，反复冻融法） 3DNA-蛋白质（DNP）的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。 可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。 0.51.0012 0.14相 对 溶 解 度NaCl（mol/L）DNP在NaCl中的溶解

42、度4去蛋白质 （1）SDS （2）苯酚法 （3）氯仿法 （4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1 5沉淀DNA 6去杂质 （1）去RNA （2）去多糖 7进一步纯化 生物材料 DNP（RNP） DNP 纤维状DNA 较纯DNA 纯DNA *原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。 破细胞1.0mol/L NaCl*去蛋白质酒精沉淀去RNA柱层析，电泳密度梯度离心去多糖（四）核酸纯度鉴定 1.A260/A280 2.电泳 （五）核酸含量的测定 1.定磷法：钼蓝比色法 2.定糖法：定糖法： 3.紫外吸收法 若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA或相当于40g/ml单链DNA或