应用参考测量程序对酶浓度赋值过程及不确定度评定指南

1、本标准规定了应用参考测量程序对酶催化活性浓度赋值及其不确定度评定的方法。本标准适用于体外诊断系统的参考测量实验室应用参考测量程序对酶催化活性浓度赋值及其不确定度评定工作。GB/T 15000.3 标准样品工作则（3） 标准样品 定值的一般原则和统计方法YY/T 0638 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质中酶催化浓度赋值的计量学溯源性（ISO 18153）WS/T 403-2012 临床生物化学检验常规项目分析质量指标赋值、测量不确定度评定、测量结果及其不确定度评定结果的报告限值在其他文献或活动中给出的信息、酶学参考测量程序信息表、LDH赋值过程及不确定度评定方法举例、使用

2、灵敏系数进行LDH测量不确定评定举例建立溯源性的途径： 参考物质 参考测量程序的选择 SI单位定义参考测量程序： 目前IFCC颁布的37时酶学测量的参考方法主要有ALT、AST、ALP、AMY、GGT、CK、LDH七个项目。2002年JCTLM（由BIPM、IFCC、ILAC组成）开始运行参考测量程序实验室之间的质量评价（RELA）活动，为酶学测量的标准化起到了重要的推动作用。参考测量程序的选择：参考测量程序主要包括：JCTLM网站列表的参考测量程序（见附录A）国家标准行业标准SI单位定义：SI单位定义为“摩尔每秒立方米（mol s-1 m-3）”。国际计量局将其命名为“卡特每立方米（kata

3、l m-3）”。是溯源等级的最高级，通常以kat/L 或U/L表示，1 katal m-3=103kat/L=6104 U/L。为了建立、证明活性浓度测量的溯源性，对参考测量程序中规定的以下步骤应进行严格控制： 称量、纯度、温度控制、分光光度计、容量器具、统计方法 具体溯源性建立过程参见YY/T 0638标准中的规定。参考测量程序的评定：CRM验证=预定限度（技术水平、应用价值）认可方案的限度，如从CRM定值报告中获得；程序使用者或组织者给出的限度，如从正确度验证物质提供者获得；经验的限度，程序使用者根据先前测量过程中获得的值制定预定的限度或依据多家实验室测量结果的中位值制定预定的限度；采用标

4、准文件给定的限度，如CNAS-CL33文件规定：IFCC参考方法对酶学参考物质的测量结果应在统计学达到无差异。CRM的选择：溯源性：CRM的特性值应有计量溯源性，并附有合理有效的测量不确定度；水平：CRM的标示值应在参考测量程序的测量范围内；基质：CRM的基质尽可能接近人血清基质； 分析物：CRM的分析物应与参考测量程序相同或是参考测量程序分析物的同工酶；最小取样量：CRM规定的最小取样量应小于参考测量程序规定用量；数量：CRM的量应满足整个实验用量；稳定性：CRM的稳定性应满足参考测量程序相关要求。参考测量程序测量精密度评定：精密度的评定，是将重复性条件或其他规定条件下实验室内SD（或CV）

5、与预定的限度进行比较。推荐的测量次数不少于10次。结果：用Grubbs法或其他适用统计方法进行异常值异常值（1 1）取舍取舍后2.850.5(约等于单侧检验的95%)推荐的限值：参考测量程序测量正确度评定：正确度的评定正确度的评定，是将测量结果的平均值与CRM标示值或正确度验证物质允许的限度进行比较。测量结果的平均值与CRM标示值进行比较时，应考虑测量程序精密度的各实验室之间的分量，不应把CRM的不确定度简单的当做Bias的允许限值使用。参考测量程序的测量结果不应使用修正因子不应使用修正因子进行修正。偏倚可接受的限值 实验室内部质量控制由于参考测量程序的特殊性，对质量控制物质有一定的特殊要求，

6、实验室应选择适宜的质量控制物质，可以选择以下几种来源的物质：a）RELA 样品；b）商品质量控制物质；c) 混合人血清等；质量控制物质的均匀性、特性值浓度水平和稳定性应能满足预期要求。样本测量在运行参考测量程序之前，实验室应对主要测量设备关键参数进行验证或内部校准，性能应符合参考测量程序要求。当参考测量程序的正确度满足要求后方可进行样本的赋值。赋值应至少进行两个实验批次，每个批次应至少进行3次测量。赋值结果的处理应使用统计学方法进行，适当时应对结果进行异常值（离群值）的取舍后再进行统计学处理。数据处理对所有测量结果使用Grubbs或其他适用统计方法进行异常值检查，剔除离群值后计算所有结果的平均

7、值和SD（或CV），当SD（或CV）落在预定的限值内时，可报告结果；如SD（或CV）未落在预定的限值内时，应分析原因，适当时重新进行赋值。 不确定度的来源分析测量模型的建立标准不确定度的评定合成标准不确定度的计算扩展不确定度的确定 不确定度的来源分析测量不确定度是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数。国家认可机构发布的相关文件中规定，参考测量实验室（校准实验室）出具的测量结果应附有测量不确定度，因此，使用参考测量程序赋值时应进行测量不确定度的评定。 不确定度的来源分析比如定义的不完整或测量方法的局限性、样本基质不同、试剂、测量条件、仪器设备、所涉及常数引起的不确定度、统计学处理以

8、及实验室测量精密度等方面。但对于酶学参考测量程序赋值的不确定度来说，还应进行参考测量程序规定限值的不确定度的评定，本文评定方法中不包括该类不确定度的评定。 定义的不完整或测量方法的局限性对于酶学测量，由于定义的不完整或测量方法的局限性引起的不确定度主要是分析物的结构不一，绝大多数的酶存在同工酶，不同的同工酶和反应液具有不同的反应性。 样本基质不同当评定不同于人血清基质样本的不确定度时，应考虑样本的基质效应。试剂试剂来源主要有两个方面：配制反应液、启动液所需的原料试剂原料试剂。如试剂纯度不足或杂质超限、试剂中含有酶的抑制剂或激活剂、不同批次试剂之间的差异、显色物质最大吸收波长等；酶学反应所需的反

9、应液、启动液反应液、启动液。如已配制好的溶液具有不稳定性、底物浓度或缓冲液。 测量条件影响结果的测量条件主要有：测量时的环境温度、湿度；反应过程中试剂的蒸发；反应过程中混合液的温度；反应时间；延迟时间；反应过程中的混匀；反应混合液的pH值。 仪器设备下列仪器设备会影响测量结果：容量瓶：使用容量瓶定容时的温度、容量瓶体积；酸度计：调节pH时，酸度计的温度补偿；分光光度计：波长准确度、半波宽、透射比的准确度、稳定性、读数重复性；秒表：时间的准确性；比色皿：光径；加样设备：加样准确度、重复性、试剂样本加样的体积比；天平：准确度、重复性、偏载误差；温度计：温度测量的准确度。 所涉及常数引起的不确定度最

10、终显色物质的摩尔消光系数（ ）的不确定度影响测量结果。统计学处理测量数据统计处理中的数值修约、异常值（离群值）取舍影响测量结果。实验室测量精密度酶学测量其测量条件比较严格，反应过程中的温度控制、溶液pH值的下降或上升、样本中分析物特性值的不稳定性直接影响测量结果，因此，测量精密度是影响测量结果可靠程度的主要因素。 可忽略的不确定度来源下列不确定度来源在此文件中予以忽略：a)在酶学测量中，考虑到底物浓度过量，同时称量使用万分之一天平进行，定容使用至少10mL的容量瓶进行，质量和体积引起的不确定度非常小，因此，溶液配制过程中引起的不确定度在此予以忽略。b) 测量过程中，由于试剂提前加热到37且反应在密闭的环境中进行，试剂蒸发引起的不确定度在此予以忽略。 c) 每次实验前配制试剂，因此试剂不稳定引起的不确定度在此予以忽略。d) 时间的不确定度对于测量结果的不确定度贡献及其微小，在此予以忽略。e) 光径的不确定度引起吸光度的测量不确定度，光径的相对标准不确定度为0.05%，酶学测量中精密度引起的测量不确定度约为1%。因此，光径的不确定度在此予以忽略。f)