罗氏COBAS Taqman检测在临床中的应用6-24

1、罗氏罗氏COBAS TaqmanCOBAS Taqman病毒载量检测在病毒载量检测在肝炎诊疗中的应用肝炎诊疗中的应用COBAS TaqMan COBAS TaqMan 肝炎病毒载量检测肝炎病毒载量检测 更灵敏，更灵敏， 更准确更准确 肝炎治疗好搭档肝炎治疗好搭档HBV HBV 感染是全球性卫生问题感染是全球性卫生问题 33% 的人在一生中会感染HBV; 成年感染者中5%-10%会转为慢性乙肝, 全球约有3.5亿慢性HBV感染者; 每年,有100万人死于与乙型肝炎相关的肝硬化或者肝癌; = 每30s 夺走一个生命 感染率最高的区域在亚洲,非洲.Lavanchy. J Viral Hepat 20

2、04; World Health Organization, 2008; Elgouhari, Cleve Clin J Med 2008不同安全、疗效和耐药性的新药面世肝炎治疗的进展肝炎治疗的进展Pegasys 2005Telbivudine 2006Lamivudine 1998Adefovir 2002Entecavir 2005伴随着实验室评估和监测的改善治疗方案必须整合诊断、检测和治疗过程中的变化来制定Tenofovir 2008不同的标志物提供不同的诊断以及治疗监控的信息不同的标志物提供不同的诊断以及治疗监控的信息诊断诊断启动治疗启动治疗鉴别鉴别初始应答初始应答预测预测治疗应答治疗

3、应答监测耐药监测耐药证明证明持续应答持续应答HBsAgHBsAgHBsAgHBsAg定量定量抗抗-HBs-HBsHBeAgHBeAg抗抗-HBe-HBe抗抗-HBc-HBcHBV DNAHBV DNAALTALTModified from Pawlotsky et al. Gastroenterol 2008HBV DNA检测在CHB疾病管理中的意义 评估疾病阶段评估疾病阶段 预测疾病进程预测疾病进程 优化抗病毒治疗优化抗病毒治疗 开始治疗开始治疗 治疗期间监测治疗期间监测 (“(“治疗路线图治疗路线图”) ) 监测耐药监测耐药 治疗终点治疗终点HBV DNA检测贯穿于乙肝治疗的整个过程高灵敏

4、、准确可靠的检测结果才能有效地指导临床治疗启启动动治治疗疗2000 IU/mL不充分应答不充分应答60-2000 IU/mL部分部分应应答答Week 12: 鉴别鉴别原原发发性无性无应应答答HBV-DNAHBV-DNA水平较基线水平下降幅度水平较基线水平下降幅度1log/ml1log/mlWeek 24: 疗疗效早期效早期预测预测HBV DNA启动治疗、鉴别初始应答、预测治疗应答由美国坦福大学医学中心由美国坦福大学医学中心KeeffeKeeffe教授（专家组）提供教授（专家组）提供Keeffe et al Clin Gastroenterol Hepatol 2007继续继续治治疗疗监测监测H

5、BV-DNA/6个月个月增加基因增加基因变变异特点不同异特点不同药药物治物治疗疗监测监测HBV-DNA/3个月个月增加增加/ /更换有效的药物治疗更换有效的药物治疗监测监测HBV-DNA/3HBV-DNA/3个月个月正确选择治疗的时机，尤其是对肝硬化低病载的患者正确选择治疗的时机，尤其是对肝硬化低病载的患者评价疗效更准确评价疗效更准确决定治疗方案（药物的剂量？单药还是联合？疗程？决定治疗方案（药物的剂量？单药还是联合？疗程？) )监测耐药，及时改变策略（换药？联合？）监测耐药，及时改变策略（换药？联合？）谨慎合理停药，减少复发谨慎合理停药，减少复发高灵敏，准确可靠的HBV DNA检测对临床治疗

6、至关重要国产PCR试剂外标法(标准曲线法)10710610510410?10?外标法的缺点：外标法的缺点：未考虑标本的个体差异、不同管未考虑标本的个体差异、不同管间扩增效率的差异、不同批次操间扩增效率的差异、不同批次操作者主观因素及污染对结果的影作者主观因素及污染对结果的影响响 未对低于未对低于10104 4扩增进行定标，扩增进行定标，因此无法准确判读低水平特异性因此无法准确判读低水平特异性扩增扩增无溯源数据无溯源数据罗氏罗氏cobascobas TaqmanTaqman核酸检测核酸检测提供的不仅仅是全自动提供的不仅仅是全自动更是更是准确可靠准确可靠的结果的结果AmpErase防污染酶防污染酶

7、闭管进，闭管出闭管进，闭管出仪器自带紫外灯消毒仪器自带紫外灯消毒高保守扩增片段的高保守扩增片段的选择，防止漏检选择，防止漏检内标定量法，定量更内标定量法，定量更准确准确罗氏独有的内部标准品定量方法罗氏独有的内部标准品定量方法 消除管间差异 内部质控品 无需外部定标 避免额外定标产生的损耗内部标准品（内部标准品（Quantification Standards, QSQuantification Standards, QS）: : 将已知浓度的人工构建核酸，加入至每个样本管中，与样本一同提取、扩增；根据内标的Ct值对样本定量样本扩增曲线样本扩增曲线内标扩增曲线内标扩增曲线The COBAS Ta

8、qMan HBV Test targets the precore/core region Highly conserved in all genotypes Avoids common mutations YMDD Double core promoter mutations Precore mutation Clinically validated* * * *Hunt C.M., et al. (2000). Hepatology 31, 10371044.Choice of PCR target is fundamental Choice of PCR target is fundam

9、ental to assay performanceto assay performance* * * *TargetTarget高保守扩增片段的选择，防止漏检高保守扩增片段的选择，防止漏检COBASCOBAS AmpliPrepAmpliPrep/COBAS/COBAS TaqMan TaqMan48/9648/96全球全球第一台全自动实时荧光第一台全自动实时荧光定量定量 PCRPCR平台平台样品进样品进-结果出结果出自动化自动化只为提供更准确的结果只为提供更准确的结果COBASCOBAS TaqMan TaqMan 肝炎核酸检测肝炎核酸检测提供卓越的检测性能提供卓越的检测性能C COBAS

10、 TaqmanOBAS Taqman HBV HBV DNADNAC COBAS TaqmanOBAS Taqman H HC CV V RNARNA灵敏度灵敏度2020 IU/mLIU/mL15 IU/mL15 IU/mL线性范围线性范围20 1.7 x 108 IU/mL15 1.0 x 108 IU/mL特异性特异性100% 100%覆盖基因型覆盖基因型A-H; pre-core mutantsGt 1-6COBAS TaqManCOBAS TaqMan肝炎病毒载量检测肝炎病毒载量检测 更灵敏，更灵敏， 更更准确准确 肝炎治疗好搭档肝炎治疗好搭档HBV DNAHBV DNA检测性能比较检

11、测性能比较cobas Taqman cobas Taqman 检测提供更卓越的性能检测提供更卓越的性能COBAS TaqmanCOBAS Taqman检测检测普通国产检测普通国产检测COBAS TaqmanCOBAS Taqman优越性优越性灵敏度灵敏度20 IU/mL500-1000 IU/mL对低浓度样本准确检出，更准确反映应答情况线性范围线性范围20 1.7 x 108 IU/mL1000 1 x 108 IU/mL宽泛的线性范围，覆盖大部分临床样本，减少二次检测定量方法定量方法内部标准品法外部标准品法避免PCR反应管间差异，确保定量准确自动化自动化全自动手工操作提高检测重复性；避免污染

12、，杜绝假阳性可溯源性可溯源性WHO标准品不明确确保结果准确性COBAS TaqmanCOBAS Taqman检测检测普通国产检测普通国产检测COBAS TaqmanCOBAS Taqman优越性优越性灵敏度灵敏度15 IU/mL500-1000 IU/mL对低浓度样本准确检出，更准确反映应答情况线性范围线性范围15 1.0 x 108 IU/mL1000 1 x 106 IU/mL宽泛的线性范围，覆盖大部分临床样本，减少二次检测定量方法定量方法内部标准品法外部标准品法避免PCR反应管间差异，确保定量准确自动化自动化全自动手工操作提高检测重复性；避免污染，杜绝假阳性可溯源性可溯源性WHO标准品不

13、明确确保结果准确性HCV RNAHCV RNA检测性能比较检测性能比较cobas Taqman cobas Taqman 检测提供更卓越的性能检测提供更卓越的性能ChChina ina I Investigator nvestigator M Multicentre ulticentre E Evaluation STUDY valuation STUDY APASL PosterAPASL PosterCHIME STUDY-CHIME STUDY-比较罗氏比较罗氏HBV DNAHBV DNA定量检测与定量检测与2 2种国产试剂种国产试剂 北京大学肝病研究所北京大学肝病研究所北京大学基础医学

14、院北京大学基础医学院首都医科大学附属友谊医院首都医科大学附属友谊医院上海交通大学附属瑞金医院上海交通大学附属瑞金医院APASL Poster 2011华西医院采用华西医院采用CAP/CTM HBVCAP/CTM HBV检测检测2020例治疗例治疗4848周普通周普通PCRPCR报告报告HBV DNA1000 copies/mlHBV DNA1000 copies/ml样本的样本的结果分析结果分析2020例患者组成特点例患者组成特点-9例服用ETV、11例服用ADV（48周）-10例大三阳、8例小三阳患者、 2例小二阳患者检测试剂病例数HBV DNA分布范围国产HBV20例1000 copies

15、/mlCAP/CTM HBV11例8例* 1例Target Not Detected103104 copies/ml104105 copies/ml*包括1例服用ETV患者普通普通PCR法法 “假阴性假阴性”率高率高达达45% (9/20)COBAS COBAS TaqmanTaqman HBV DNA HBV DNA更准确监测疗效及判断治疗终点更准确监测疗效及判断治疗终点 全球有2亿人感染HCV 流行率2.23.0%13 1.7亿慢性携带者2 HCV相关的肝脏疾病每年夺取超过25万人的生命 1 80% 的感染者没有任何的临床症状5,6 4085% 的感染者未得到诊断712HCVHCV临床背景

16、临床背景1Chevaliez. Clin Microbiol Infect 2011; 2WHO 2003; 3Lavanchy. Liver Int 2009; 4Wiessing et al. Eurosurveillance 2008; 5Hoofnagle. Hepatology 2002; 6Lemon et al. Fields Virology 2007; 7http:/ 8Schlosser et al. EASL 2009; 9Vermehren et al. DGVS 2010; 10Gane. New Zealand Doctor 2007; 11Wild. Gastro

17、enterology and Endoscopy News 2010; 12/hep-c-facts-stats.html. 中国丙肝临床报告病例逐年递增中国丙肝临床报告病例逐年递增 中国卫生部公告. 庄辉. 2012世界肝炎日全国丙肝专题会议. 2114539380529277068192378108446131849153039173872020000400006000080000100000120000140000160000180000200320042005200620072008200920102011中国目前约有1000万例丙

18、肝感染者HCVHCV临床背景临床背景 6575% 感染发展为慢性丙肝，继而导致肝硬化，肝衰竭及肝细胞癌血液肝组织病毒复制病毒持续存在慢性HCV感染急性HCV感染Initial infection病毒清除 自限性感染免疫应答终末期肝病肝细胞癌WHO 2003.肝硬化HCV HCV 基因型基因型 HCV病毒有6种主要的基因型 每种基因型有各种不同的亚型 基因型的分布有明显的地域特征 基因分型非常重要，不同基因型的疗效和疗程均不同Hoofnagle. Hepatology 2002; Lemon et al. Fields Virology 2007.丙型肝炎丙型肝炎 实验室检测指标实验室检测指标抗

19、抗-HCV-HCV 高危人群筛查及HCV感染者的初筛 非保护性抗体，转阴与否不作为抗病毒疗效的指标 HCV RNA-HCV RNA-诊断疾病及治疗管理最关键的指标 病毒感染、具有传染性和病毒复制的标志 直接代表病毒血症的水平 即使体内HCV含量很低，也可通过real time RT-PCR方法检测到HCV RNA 较抗-HCV-HCV更早出现更早出现，缩短窗口期缩至12天左右 IL-28B, Genotype, ALT IL-28B, Genotype, ALT HCV RNAHCV RNA核酸的检测是核酸的检测是目前指导丙肝诊疗的最目前指导丙肝诊疗的最关键指标！关键指标！ 丙型肝炎丙型肝炎R

20、GTRGT策略策略对关键时间对关键时间节点治疗应答的定义节点治疗应答的定义病毒学反应病毒学反应定义定义RVR RVR 治疗治疗4 4周时，周时，HCV RNA HCV RNA 转阴转阴 (50 IU/mL50 IU/mL) ) EVREVRcEVRcEVR( (完全完全EVR)EVR)治疗治疗4 4周时，周时，HCV RNA HCV RNA 阳性，阳性，但但1212周时转阴（低于检测低限周时转阴（低于检测低限 50 IU/mL50 IU/mL ）pEVRpEVR( (部分部分EVR)EVR)治疗治疗1212周时，周时，HCV RNA HCV RNA 阳性，阳性，但相对于治疗前基线下降但相对于治疗前基线下降 2 log2 log1010非非EVREVR治疗治疗1212周时，周时，HCV RNA HCV RNA 下降下降 2 log2 log1010 值值RVR (Rapid Virus Response ,RVR (Rapid Virus Response ,快速病毒学应答快速病毒学应答) )EVR (Early Virus Response ,EVR (Early Virus Response ,早期病毒学应答早期病毒学应答) )临床医生需要符合现有指南要求的敏感临床医生需要符合现有指南要求的敏感的的HCV HCV RNARNA检测方法检测方法1. Craxi A, et al.