内膜系统与蛋白质分选

1、第九章 内膜系统与蛋白质分选和膜运输9.1 细胞质膜系统及研究方法基本概念膜结合细胞器(membrane-bound organelle): 指细胞质中所有具有膜结构的细胞器;细胞质膜系统(cytoplasmic membrane system): 指细胞内那些在生物发生上与质膜相关的细胞器;内膜系统(endomembrane system): 指内质网、高尔基体、细胞核、溶酶体和液泡5类膜结合细胞器，因为它们的膜是相互流动的，处于动态平衡。膜结合细胞器的种类和功能细胞器每细胞所含数量/个体积比/% 胞质溶胶154 线粒体170022 内质网112 细胞核16 高尔基体13 过氧化物酶体400

2、1 溶酶体3001 (胞)内体2001肝细胞中主要膜结合细胞器的体积比真核细胞膜结合区室的主要功能细胞器(区室)主要功能胞质溶胶代谢的主要场所,蛋白质合成部位细胞核基因组存在场所,DNA和RNA的合成地内质网脂的合成场所,蛋白质合成和集散地高尔基体蛋白质和脂的修饰,分选和包装溶酶体细胞内降解作用(胞)内体内吞物的分选线粒体氧化磷酸化位点叶绿体光合作用过氧化物酶体毒性分子的氧化膜结合细胞器在细胞内的分布是有层次的.内膜系统的特点与动态性质特点内膜封闭的区室执行独立的功能动态性质Biosynthetic pathwaySecretory pathwayEndocytosis pathway膜结合细

3、胞器的进化起因遗传信息的扩大 体积的增大表面积与体积比值失调物质代谢速度受限对策:细胞内部结构区域化 途径：内共生途径 细胞质膜内陷途径。9.1.2 A few approaches to the study of cytomembranesAutoradiographyPalade and Jamieson: In the autoradiography experiment of pancreatic tissue, using this approach, it was proved that ER is the site of synthesis of secretory protei

4、ns and then “pulse-chase” experiment first defined the biosynthetic pathway and tied a number of seemingly separate membranous compartments into an integrated functional unit.Secretory granuleRough ERSilver grainsGreen Fluorescent Protein (GFP)GFP is a small protein which was encoded by a gene of je

5、llyfish.To use this technique, DNA encoding GFP is fused to DNA encoding the protein to be studied and the resulting chimeric DNA is introduced into cells that can be observed under the microscope.GFPThe eleven strands form the staves of a barrel.VSV: vesicular stomatitis virus疱疹病毒Biochemical Analys

6、is of Subcellular FractionsVesicles are isolated from endomembranes by cell fractionation and then their composition and functional properties can be determined by biochemical analysis and immuno-electromicroscopy. For example, enzymatic activities and the capacities of transporting newly synthesize

7、d proteins of the microsomes and the role of Golgi complex in the stepwise assembly of complex carbohydrates.Cell-free systemsResearchers have used cell-free systems to identify many of the proteins that are involved in specific steps of protein trafficking.The formation of coated vesicles in a cell

8、-free systemStudy of genetic mutants9.1.3 内膜系统与蛋白质分选蛋白质分选定位的时空概念合成的蛋白何时转运?蛋白质在细胞中的定位蛋白质分选定位的三种机制Transport through nuclear poreAcross membrane transportVesicle translocation信号序列指导蛋白质的正确运输信号序列的类型入核信号(nuclear localization signal):指导核蛋白的运输;引导肽(leading peptide):指导线粒体,叶绿体,和过氧化物酶体蛋白的运输;信号肽(signal peptide):

9、指导内膜系统的蛋白质运输.信号序列对蛋白质没有特异性9.2 内质网(endoplasmic reticulum)9.2.1 形态结构和化学组成类型Rough endoplasmic reticulum (RER) Smooth endoplasmic reticulum (SER) 特殊类型的内质网 微粒体(microsome) 肌质网(sarcoplasmic reticulum)The isolation of purified rough and smooth microsomes from the ER内质网的化学组成和酶类内质网的标志酶是葡萄糖-6-磷酸酶。细胞色素P450在内质网膜

10、中 最为丰富。9.2.2 光面内质网的功能糖原分解释放游离葡萄糖Glycogen granules in a hepatocyte.糖原糖原磷酸化酶G-1-PG-1-PG-6-P葡萄糖磷酸变位酶G-6-P葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶Pi类固醇激素的合成光面内质网能够合成胆固醇，然后将胆固醇氧化、还原、水解进一步转变成各种类固醇激素。甲羟戊酸活化的异戊二烯三十碳六烯some organs (adrenal glandand gonads, for example) use cholesterol as a precursorfor steroid hormone production孕烯醇酮黄体酮皮

11、质醇睾丸激素雌二醇肾上腺酮醛甾酮脂的合成与转运合成甘油三脂(triacylglycerol)磷脂合成在光面内质网上合成的磷脂先作为内质网膜的构成成分,然后再转运到其他的膜上.磷脂转运解毒作用(detoxification)光面内质网含有丰富的氧化酶系统(如细胞色素P450、NADH细胞色素C还原酶等)能使许多有害物质由脂溶性转变成水溶性而被排出体外.此反应主要在肝细胞的sER中进行.Ca2+的调节作用肌质网是细胞内特化的光面内质网,有高浓度的钙结合蛋白,每个钙结合蛋白可以结合30个左右的Ca2+. 9.2.3 糙面内质网的功能蛋白质合成与转运信号序列的发现和证实Redman和Sabatini用

12、分离的RER小泡研究膜结合核糖体合成的蛋白质去向.1971年美国洛克菲勒大学的Blobel等提出了信号序列(signal sequence)的概念。信号序列的间接证据1972年, Milstein 和他的同事发现:a.从细胞质分离的IgG轻链:多20个氨基酸残基b.释放到细胞外的IgG轻链:少20个氨基酸残基信号肽的证实 加与不加rER小泡,产物不同 蛋白水解酶水解实验 多聚核糖体的离体翻译蛋白水解酶水解实验多聚核糖体实验信号序列的一般特征及早期信号假说 一般特征长度: 1535 氨基酸残基;结构: N端含1或多个带正电荷氨基酸,其后是612个连续的疏水残基;功能: 在蛋白质合成中将核糖体引导

13、到内质网,进入内质网后通常被切除.1975年，Blobel等正式提出了信号假说合成始于游离核糖体;N端信号序列靠自由碰撞与内质网膜接触,然后插入内质网的膜;蛋白质以袢环形式穿过内质网的膜;蛋白的存在方式: a.若信号序列被信号肽酶切除:完全进入腔 b.若是停止转移信号: 膜蛋白Blobel received the Nobel Prize for medicine in 1999信号假说的补充 Signal recognition particle, SRP 停靠蛋白(docking protein, DP)a. 是SRP在内质网膜上的受体蛋白;b. 两个亚基:亲水的亚基, 疏水的亚基.易位子

14、( translocon) a. Multiple copies of the Sec61 complex assemble to form a cylinder translocon channel b. 56 nm high and 8.5 nm in diameter, with a central pore, roughly 2 nm in diameter c. 哺乳动物细胞中有三种类型的Sec61, 即、 和 d. Sec61有10个跨膜螺旋易位子蛋白质共翻译转运的机制信号假说膜蛋白的共翻译转运机理Start-transfer signal在跨膜时保持正电荷一端朝向胞质溶胶面内部信

15、号序列与单次跨膜蛋白终止转移肽与单次跨膜蛋白二次跨膜蛋白与多次跨膜蛋白Bip蛋白在ER蛋白质的转运和装配中的作用蛋白质在内质网中的修饰N-糖基化(protein glycosylation)指在rER上合成的蛋白与寡糖基共价连接羟基化除了N-糖基化以外,新生肽的脯氨酸和赖氨酸要进行羟基化,形成羟脯氨酸和羟赖氨酸.这种反应只发生在少数蛋白质身上.Protein glycosylation in the rough ER形成脂锚定蛋白GPI：糖基磷脂酰肌醇双硫键的形成PDI可以切断二硫键形成自由能最低的构象，以帮助新合成的蛋白质重新形成二硫键并处于正确折叠的状态。9.3 高尔基体Golgi bod

16、y, Golgi apparatus,Golgi complex)9.3.1 高尔基体的功能 蛋白质和脂的运输 ER与高尔基体内侧面间的运输蛋白质从高尔基体内侧网络向外侧网络运输 蛋白质的糖基化高尔基体对蛋白质的糖基化修饰作用是在高尔基体的各个特异的功能区室中进行.Endo H: highly specific endoglycosidase(糖苷内切酶)在高尔基体中进行的糖基化是O-连接糖基化N-糖基化核心结构复合寡聚糖高甘露糖基寡糖 蛋白聚糖的合成The Gologi complex is also the site of synthesis of

17、 most of a cells complex polysaccharides, including the glycosaminoglycans found in the extracellular matrix of animal cells and the pectins and hemicellulose found in the cell walls of plants. 蛋白原的水解 蛋白质的分选在内质网上合成的蛋白经过高尔基体分别转运至特定部位称为分选(sorting).9.4 溶酶体(lysosome)动物细胞内的一种细胞器小球状,外面由一层单位膜

18、包被溶酶体含有50多种水解酶类,在细胞内起消化和保护作用当细胞被损伤时,溶酶体可释放出水解酶类,使细胞自溶9.4.1 溶酶体的形态结构溶酶体的形态溶酶体是一种异质性(heterogenous)细胞器,呈小球状。大小变化很大，直径一般0.250.8m，最大的可超过1m,最小的直径只有25-50nm。溶酶体膜的稳定性 溶酶体膜含有各种高度糖基化的膜整合蛋白; 溶酶体膜含有较多能促进膜稳定的胆固醇; 溶酶体膜有H+泵和Cl通道.9.4.2 溶酶体的发现与溶酶体的酶类溶酶体及其酶类9.4.3 溶酶体的类型 1.初级溶酶体(primary lysosome)2.次级溶酶体(secondary lysos

19、ome) (1)自噬性溶酶体(aotolysosome) (2)异噬性溶酶体(heterolysosome)3.后溶酶体(post lysosome)9.4.4 溶酶体的功能 吞噬作用(Phagocytosis) 自噬作用(Autophagy) 自溶作用(Autolysis) 其它的生理功能胚胎发育和形态建成受精作用(fertilization) 9.4.5 溶酶体的生物发生 溶酶体酶的M6P标记 溶酶体的甘露糖6-磷酸分选途径 (胞)内体(endosome)初级内体(early endosome): 由于细胞的内吞作用而形成的含有内吞物资的膜结合细胞

20、器.次级内体(late endosome):初级内体经过发育,其结合物上的受体脱离,pH值比初级内体小的成熟内体.9.5 细胞的分泌与内吞作用9.5.1 细胞分泌(cell secretion) 细胞分泌活动的过程动植物细胞将在糙面内质网上合成而又非内质网组成部分的蛋白质和脂通过小泡运输的方式经过高尔基体的进一步加工和分选运送到细胞内相应结构、细胞质膜以及细胞外的过程。内质网:高尔基体:细胞质膜 分泌活动的类型组成型分泌途径 (Constitutive secretory pathway)调节型分泌途径 (Regulated secretory pathway)9.

21、5.1.3 极性细胞中的蛋白质运输 胞吐作用与膜的融合概念胞吐作用与膜融合9.5.2 胞吞作用(endocytosis)吞噬作用(phagocytosis) 巨噬细胞(macrophage) 中性细胞(neutrophils)吞饮作用(pinocytosis) 液相内吞(fluid-phase endocytosis) 吸附内吞(absorption endocytosis)phagocytosispinocytosis巨噬细胞的吞噬作用中性细胞的吞噬作用Receptor-mediated endocytosis根据胞吞的物质是否有专一性，将胞吞作用分为受体介导的胞吞作用和非特异

22、性的胞吞作用。Receptor mediated endocytosis在受体介导的胞吞作用过程中，不同类型的受体具有不同的胞内体分选途径：大部分受体返回它们原来的质膜结构域， 如LDL受体又循环到质膜再利用。有些受体不能再循环而是最后进入溶酶体，在 那里被消化,导致细胞表面受体浓度降低，称 为受体下行调节(receptor down-regulation)。有些受体被转运至质膜不同的结构域，该过程 称作跨细胞的转运(transcytosis)。Possible fates for transmembrane receptor proteins that have been endocytosis受体与配体的命运受体介导的LDL的胞吞作用9.6 Mechanism of vesicular transport 小泡运输的三个关键问题 小泡是如何形成的?为什么有些膜整合 蛋白能够被选择性地包入小泡? 不同类型的运输小泡具有什么样的信号 标记，这些标记如何帮助它们同特定类 型细胞器的膜结合? 运输小泡的膜同靶膜相互融合的机理是什么?9.6.1 运输小泡的类型与分选信号被膜小泡(coated vesicles)类型披网格蛋白小泡(clathrin-coated vesicle)COPII被膜小泡(COPII coated vesicles)COPI被膜