瘤胃发酵试验方法

1、瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。每升培养基中含有15.71mg CaCl22H2O,11.90mg MnCl24H2O, 1.19mg CoCl26H2O, 9.52mg Fe Cl36H2O, 0.143g MgSO47H2O, 7

2、6.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。发酵

3、瓶封盖!气压平衡后置于39培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。4.3挥发性脂肪酸的测定取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20冰箱保存。测定前解冻,12,000rpm

4、离心lomin,取上清液0.6uL测定。优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130,进样器温度为180,检测器温度为180)。高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。4.4氨态氮浓度测定将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20保存。测定前解冻,于4条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967)4.5微生物蛋白浓度测定取瘤胃内容物7ml保存在-20冰箱测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。取2ml上清液

5、在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。1.4.6原虫计数将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold等,1987。4.7氢的还原力根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B)其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。对

6、瘤胃微生物发酵参数的影响1材料与方法1.1试验动物、日粮组成与试验设计试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。2样品采集与分析饲料采食量分别在每期的11-13天测定。记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食

7、后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(内标测定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷冻瘤胃液解冻后于12,ooog/min在4条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。气相色谱仪(岛津,GC-14B,日本)具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m0.32rnm0.25

8、四膜(Supelco,美国)。汽化室温度为180,柱温135,检测室温度180，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/ min,空气流量400mL/ min。根据Demeyer(1991)的方程计算CH4产量和氢利用率。方程如下:瘤胃可发酵有机物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) vCH4产量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)l00022.4(4v)2Hr(%)=(4M+2P+2B)100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。.以上均为净摩尔数。第二份取4ml瘤胃液样品加入等

9、量的0.2mol/L的盐酸-20冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。样品解冻后在4条件下15,000g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度(Chaney,1962)第三份取7ml样品-20保存用于微生物蛋白的测定室温解冻,取3ml混匀样品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。对原虫、产甲烷菌及细菌区

10、系的影响1材料与方法1.1动物、试验设计及采样同本章第一节。1.2用于原虫PCR/DGGE分析的样品保存及引物比较比较-20冷冻保存和液氮保存PCR/DGGE的样品效果及两对常用瘤胃原虫PCR/ DGGE 引物的筛选.2.1实验动物和瘤胃内容物的收集随机选取4只(A、B、C和D)装有永久性瘤胃瘩管的波尔山羊与本地山羊杂交后代,自由采食全粗料。实验期间分别于饲喂前0h和饲喂后1、2、4和8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,4层纱布过滤,迅速投入液氮和-20保存以备瘤胃微生物基因组DNA的提取。1.2.2瘤胃内容物总DNA的提取参照Zoetendal等(1998)方法,将液氮和-20保存样品室温解冻,取

11、解冻后混匀的瘤胃内容物样品1.smL,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯仿/异戊醇提取瘤胃内容物总DNA。1.2.3PCR扩增反应以瘤胃内容物总DNA为模板,两对原虫特异性引物进行比较,对原虫的185rRNA进行特异PCR扩增扩增引物序列见表2-2。1.3山羊瘤胃微生物基因组DNA提取本章第一节所采集瘤胃液样品迅速保存在液氮中以备基因组DNA提取（DNA提取效果优于冷冻,见原虫DGGE方法优化部分)(Zoetendal等,1998)。所提取基因组DNA用于原虫、细菌和产甲烷菌区系及微生物的定量分析。1.4瘤胃微生物的DGGE引物表2-2试验中使用的PCR引物Table 2-2 The prime

12、rs used in the experiment使用特异的原虫、细菌和产甲烷菌DGGE引物(表2-2)扩增原虫18srDNA、细菌和产甲烷菌16srDNA。使用Bio-Rad Dcode系统进行DGGE电泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝胶对原虫区系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝胶对细菌区系分析,6%的丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝胶对产甲烷菌区系分析。先200V预电泳10min,然后85V电泳16h。对DGGE胶进行银染(Muyzer,1993)。DGGE胶上主要的和特异的条带用洁净的刀片和枪头切下移入。1.5ml离心管中,37或室温过夜再进行PCR扩增

13、,纯化PCR产物后测序,在GenBank上比对寻找最相似菌。对山羊瘤胃微生物数量的影响1材料与方法1.1试验设计本章第一节山羊在体试验不同时间点的DNA样品进行分析研究,以山羊瘤胃总细菌为参照,对瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相对数量进行定量分析。1.2仪器设备!试剂与耗材实时定量PCR仪(ABI7300,美国)如图2-12。实时定量PCR反应采用SYBR Green染料法,荧光染料预混试剂为SYBR Green Realtime PCR master Mix with ROX(TOYOBO,Japan)。实时定量PCR反

14、应在八联管上进行(Axgen,USA)表2-4 定量PCR引物Table 2-4 PCR Primers for qPCR assay1.3原虫计数取瘤胃液与等量9%的甲醛溶液混合,于4保存用于原虫计数。样品需进一步稀释以便于计数,原虫总数和五种原虫在显微镜下计数(Newbold,1987)。为保证所有个体大小不同原虫都能被准确计数,对计数板进行了改装,使计数室高度增加为0.25mm。1.4定量PCR反应体系与扩增条件使用上述DNA样品对瘤胃微生物进行了定量分析(如总菌,真菌,产甲烷菌,黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌),以上微生物的特异性引物见表2-4(Denman等,2006)。使用荧光染料

15、SYBR Green进行标记,使用瘤胃微生物特异性引物,对微生物进行PCR扩增,根据定量PCR的循环数对微生物进行相对定量分析(ABI 7300,USA)(Denman等,2006;Chen等,2008)。使用ABI 7300 SDS version 2.0软件对数据进行分析,根据方程2-ct计算瘤胃产甲烷菌、真菌、黄化瘤胃球菌和产唬泊酸丝状杆菌相对于总菌的数量变化(Livak等,2001;Chen等,2008)。实时定量PCR反应体系为20ul,反应体系组成见表2-5。反应体系的配制在无菌超净台上进行,使用2ml灭菌的PCR管先配制反应体系母液。而后使用清洁的移液器将母液分装到八联管中,每孔

16、巧川,再加入己稀释5倍的DNA模板,设三个重复。实时定量PCR的扩增条件见图2-13:(l)95,10秒;(2)95,30秒;60,1分钟;共40个循环;(3)熔解曲线分析扩增产物的特异性,温度以l/30s的速度从60上升到95。实时定量PCR反应的熔解曲线见图2-14。熔解曲线分析发现,扩增产物的熔解曲线具有明显的尖峰。产甲烷菌的熔解曲线有双峰存在(图2-14A),因为产甲烷菌有产甲烷杆菌和产甲烷球菌存在,使熔解曲线出现双峰,两个熔解曲线出现在84.5和88.8。产玻拍酸丝状杆菌(图2-14B)、黄化瘤胃球菌(图2-14C)和瘤胃真菌(图2-14D)的熔解曲线为单峰,且位置单一,熔链温度分别

17、出现在87.8、84.5和81.0附近,说明PCR扩增产物特异性高,不存在引物二聚体与非特异性扩增。米曲霉培养物与蛋氨酸羟基类似物对奶牛瘤胃发酵和泌乳性能的影响_孙华米曲霉培养物与蛋氧酸经基类似物对不同粗料底物瘤胃产气及发酵特性的影响1材料与方法1.1试验材料米曲霉培养物(AOC)由BioZyme公司提供,产品名为Amaferm, Amaferm为黄色固体,含有的成分包括(DM为基础):DM为93.5%,CP为19.5%,NDF为52.4%, ADF为16.1%,灰分为7.8%,粗脂肪为3%;蛋氨酸经基类似物(HMB)为固态形式的蛋氧酸经基类似物钱盐,由NOVUS公司(诺伟司国际有限公司)提供

18、,产品名为MFP, DM含量为99%,CP占85%,含有84%的蛋氛酸。1.2试验设计体外试验底物的精粗比为50:50,其中精料为玉米,粗料分别为羊草(CWR)、苜蓿 (AH)、青贮玉米(CS)和玉米梧(CST)之一,其营养成分组成见表2-1。每一培养底物均按照23因子设计分配试验处理,生产中AOC每头牛每天的添加量为5-l0g,而HMB的添加量为25g,瘤胃体积按照50L计算,因此对应30 mL的痛胃培养液,因此体外分别添加AOC (0、3、6 mg)和HMB (0、15 mg),每个处理有3个重复。1.3瘤胃液供体动物及饲养4头装有永久性瘤胃瘦管的奶牛(泌礼天数为213土6. 5)作为瘤胃

19、液供体动物,词嘱日粮精粗比为55:45,词料配方见表2-2,日词嘱3次,自由饮水。1.4产气试验程序采用Menke和Steigass ( 1988)的Syringe系统(100 mL注射器),进行人工瘤胃体外产气试验,如图2-1所示。人工唾液的配制按Menke和Steingass等(1988)方法进行,配方如下:在520.2 mL蒸馏水中依次加入208.1 mL缓冲落液(B)、208.1 mL常量元素溶液(C)、0.1 mL微量元素溶液(A)、l.0mL刃天青指示剂_ (D),62.4mL还原刻溶液(E),通入CO:厌氧使其饱和,直至溶液由淡蓝色转变为无色。每个体外装置中底物添加量为200mg

20、DM (精粗比为50:50,精料为玉米,粗料分别为羊草、苜着、青贮玉米和玉米秸之一),同时分别设置一个空白对照组(不添加底物、AOC和HMB)和一个标准羊草组。试验当天在奶牛晨饲前抽取3只瘘管牛的瘤胃液,4层纱布过滤到提前预热的收集瓶中,于39C水浴中保温,并同时通入CO2保持厌氧状态,待用。人工唾液按Menke方法(1988)配置,将人工唾液与瘤胃液按照2: 1的体积比例混合均勻,然后用三通管准确吸取CO2饱和的瘤胃混合培养液30 mL移入每个培养管中,摇晃培养管使底物和瘤胃液混合后,排出气泡,加上夹子,读数,然后将其置于39C的水浴摇床中进行体外发酵培养。在同样条件下重复上述体外产气试验1

21、次,两次标准羊草产气量相对偏差小于10%即可,若相差太大,应考虑重做。培养的3、6、9、12和24h记录产气管的刻度读数(读数时轻摇产气管,旋动管塞后读数,以管塞刻度的中部为准)。1.5测定指标及方法读取培养管的刻度,以计算产气量、潜在产气量、产气速率和有机物消化率。培养24 h终止后,立即测定发酵液pH;取体外发酵瘤胃液上清液1 mL,加入0.2 ml 8.2%偏碟酸,4C保存测定挥发性脂肪酸(VFA)的浓度;取瘤胃混合液,采用比色法测定氨态氮(NH3-N)浓度、嚷呤法测定微生物蛋白(MCP)产量。1.5.1产气量GPt=200 (Vt-Vo) /W式中,GPt为样品在t时刻的产气量(mL)

22、; Vt为样品发酵th后,培养管刻度读数;Vg为样品在开始培养时,培养对应的刻度读数;W为样品干物质重量(mg)。1.5.2产气参数利用 fit curve 软件(MLP; Lawes Agricultural Trust, 1991 ),根据Orskov和McDonald (1979)的产气模型公式将各样品在3、6、9、12、24h时间点的产气量代入,计算消化动力参数。模型公式为:GP = a + b (l-exp-ct),其中GP是t时间的产气量,a为快速产气部分,b为缓慢产气部分,C为b的产气速度常数,a+b为潜在产气量。1.5.3体外有机物消化率(IVOMD)根据Menke和Stein

23、gass (1988)提出的公式计算体外有机物消化率,IVOMD (%) = 0.986GP + 0.0606CP + 11.03 其中 GP 为 24 h 产气量(mL/200mg), CP 为粗蛋白含量(g/kg)。1.5.4 pH 值使用S40 Mutimin型pH计测定样品pH值。1.5.5挥发性脂肪酸取混合好的瘤胃液样品,于4、20 000g离心l0min,取离心后的上清液加入专用的气相小瓶,用气象色谱仪测定瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的含量。测定条件:柱温180,气化室温度200,检测室温度220 ,载气使用高纯氮气,总压力90kpa,总流量37.2mL/min,

24、柱流量0.67mL/min,线速度23.4cm/sec,分流比50,吹扫流量3mL/min,循环流量8mL/min,氧气流量 40mL/min,空气流量 400mL/min。1.5.6氛态氣浓度采用比色法测定瘤胃液样品的氨态氮浓度(胡伟莲,2005),并进行了适当的修改。以0.2M盐酸溶解0.382g氯化铵,定容至l00mL,作为保存液,4C保存。用蒸馏水将l0mL保存液稀释定容至l00mL,为工作液,含氮量l0mg/l00mL。取工作液0、1、2、4、6rnL分别置于50mL容量瓶内,依次加入蒸馏水10、9、8、6、4mL,再用0.2M盐酸定容。成为每l00mL含氮量0、0.2、0.4、0.

25、8、1.2mg的标准系列溶液。取标准系列溶液0.lmL分置于2mL离心管内,各管中依次加入亚硝基铁氰化纳水杨酸纳溶液0.5mL和次氯酸纳氢氧化纳溶液0.5mL,摇勻、静置l0min后,用Eppendorf枪吸取200ul混合液用SpectraMax M5酶标仪比色。波长700nm,用不含氮的0号管液作空白对照。记录各吸光值。用吸光值作自变量,溶液含氮量作从变量导出回归方程式。样品测定:取ImL瘤胃液在4000rpm离心l0min,量取0.lmL上清液和0.5mL蒸饱水置于5mL离心管内,再加入2.4mL 0.2M盐酸,稀释上清液30倍,摇勻。比色操作同。把测得的吸光值代入回归方程式,计算样品中

26、的氨氮含量。1.5.7微生物蛋白产量采用噪呤法测定微生物蛋白产量(胡伟莲,2005)。A.酵母RNA标准曲线的制作。分别称取5、15、25、35、45和55mg酵母RNA于l0mL离心管中,加入 2mL0.6MHC104, 95C水浴 1h,冷却。分别加入6mL28.5mM的NH4H2PO4溶液,95C水浴15min,冷却后在3000g, 4C条件下离心l0min。取0.8mL上清夜,向上清夜中加入3mL0.2M的NH4H2PO4溶液,并用12.5ul的85%磷酸调整溶液pH至2-3。取调整pH值后的溶液3.8mL,向其中加入0.2mL0.4M的AgNO3溶液,混合后于4避光过夜。过夜后于30

27、00g,4条件下离心l0min,弃上清液;用4.5mLpH=2的蒸德水冲洗沉淀;再于3000g,4条件下离心l0min,弃上清液。向沉淀中加入5mL0.5M的HC1溶液,混匀,95C水浴30min后,以3000g离心1 0min ;上清液用0.5MHC1稀释40倍后,以0.5M HC1溶液作参比,在260nm下用DU800分光光度计比色,根据光密度值作出标准曲线。B.样品微生物蛋白浓度的测定。取8mL瘤胃液于3个l0mL离心管中,在20000g,4条件下离心20min;弃上清液后加入2.104niL0.6MHC104,于95C水浴1h,冷却。按照制作标准曲线的步骤-操作。以0.5M HC1溶液

28、作参比,在260nm下比色,根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值。根据以下公式计算微生物蛋白氮产量:微生物蛋白氮(mg/mL) =RNA测定值(mg/mL) RNA含気量/细菌氮中RNA含氣量稀释倍数其中,RNA含氮量为17.83%,细菌氮中RNA含氮量为10%。微生物蛋白(MCP,mg/mL)=微生物蛋白氮(mg/mL) 6.25米曲霉培养物与蛋氨酸幾基类似物对不同粗料底物瘤胃微生物及其酶活的影响1材料与方法1.1试验材料试验材料为本章第一节体外培养24 h后终止发酵的混合培养物。1.2测定项目及方法1.2.1微生物酶活1.2.1.1 试剂(1 ) 0.2mol/L碟酸缓冲溶液(pH=6)

29、a,称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H20)71.64g,用蒸饱水溶解,并定容至1 000ml; b.称取磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)31.21g,用蒸馏水溶解,并定容至1 000ml。取a液123ml,加b液877ml混合均勻,配制成1000ml 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液,用pH计校正至pH为6.0备用。(2)0.5%羧甲基纤维素纳(CMC) (Sigma-C9481)溶液0.5g的CMC悬浮于80ml缓冲液中,且在微热(60度)和揽拌的情况下,直至完全溶解,最终用缓冲液定容至l00ml。(3)0.5%微晶纤维素(Sigma-MKBB4236)准确称取0. 5g微晶纤维素加至

30、100ml缓冲液中,60水浴揽拌溶解后,4C保存备用。(4)0.5%木聚糖(Sigma-X4252)加热揽拌器上加热大约60ml缓冲液到60度;慢慢加入0.5g木聚糖,加热煮沸同时揽拌,不断搅拌下过夜冷却,添加蒸饱水定容至100ml。(5)0.5%可溶淀粉(Sigma-S4126)称取0.5g淀粉,用水调成浆状物,在拔动下缓缓加入70ml缓冲液中,然后,以30ml缓冲液分几次冲洗装淀粉的烧杯,洗液并入其中,加热至完全透明,冷却,定容至l00ml。此溶液需要当天配制。(6)3,5-二销基水杨酸(DNS)试剂称取DNS3.15g,加水500ml,拔拌5s,水浴至45C,然后逐步加入100ml氢氧化

31、纳溶液,同时不断揽拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48C)。再逐步加入四水酒石酸钾纳91.0g、苯酸2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45C水浴加热,同时补充加水300ml,不断揽拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1 000ml。用烧结玻璃功率器过滤,取滤液,於存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7d后可以使用,有效期为6个月(张顺英,2007)。(7)葡萄糖、木糖标准溶液称取1g无水葡萄糖(105C),用缓冲液溶解并定容至l00ml,4C避光保存3天内使用,或在-20C长期保存。1.2.2.2测定步骤(1)葡萄糖(Sigma-

32、G6152)标准曲线制作将葡萄糖原液(l0mg/ml)配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 和 0.7mg/ml的葡萄糖标准液。取24个2ml的离心管,其中21支试验管3支空白对照管,编号后依次加入0.4ml对应的葡萄糖标准液,向各管中加入0.2rnl磷酸缓冲液,然后各管加入0.8rnlDNS溶液,摇匀后沸水浴5min,取出后用流水冲洗冷却,540nm波长下比色,以空白为基础,以净吸光度为横坐标,葡萄糖量(mg)为纵坐标,制备标准曲线,得出回归方程。(2)木糖(Sigma-X3877)标准曲线制作步骤同葡萄糖标准曲线的制作,只是将葡萄糖换成木糖。(3)瘤胃液的处理将瘤胃液在

33、冰上进行超声波处理(Giri等,2005),得到的样品进行离心,28000xg, 4C, 20min,澄清上清液作为粗酶液用于瘤胃液各种酵活的测定,采用DNS法进行羧甲基纤维素酶(CarboxyHMBhyl celluse,CMCase)、木聚糖酶、a-淀粉酶活性的测定(孙宏远,2006)。(4)羧甲基纤维素酶活性的测定取4个2ml离心管编号,一支空白管,三支样品管;分别向4支离心管中准确加入0.4ml0.5%羧甲基纤维素钠底物溶液,同时放入39水浴中预热5分钟,空白管暂时不加酶液,其余样品管加入0.2ml稀释的酶液;将4支离心管同时放入39C水浴恒温培养30min(精确),培养结束后迅速取出

34、,立即加入0.8mLDNS溶液终止反应,再在空白管中加入0.2mL酶液,加塞摇匀后在沸水浴中煮沸5min,取出后用循环水冷却5min至室温,以空白管为对照,在分光光度计540nrn波长处进行比色。(5)微晶纤维素酶活性的测定同羧甲基纤维素酶活性的测定,只是将底物换成0.5%微晶纤维素溶液。(6)木聚糖酶活性的测定同羧曱基纤维素酶活性的测定,只是将底物换成0.5%木聚糖溶液。(7)淀粉酶活性的测定同羧甲基纤维素酶活性的测定,只是将底物换成0.5%淀粉溶液。1.2.2.3酶活力单位定义:每分钟每毫升瘤胃液释放还原糖的酶量为1个酶活力单位。羧甲基纤维素酶和淀粉酶对应的是还原糖为葡萄糖,木聚糖酶对应的

35、还原糖为木糖。计算公式:酶活性(IU) = (Cl000D) / (VTM)C:由标准曲线得出的葡萄糖(或木糖)浓度mg;D:酶液的稀释倍数;V:加入的原酶液体积(0.2mL);T:反应时间;M:葡萄糖或木糖的分子量。1.2.3微生物定量方法1.2.3.1 DNA的提取及浓度检测参照 Yu 等(2004)的 Repeat Bead Beating Plus Column (RBB+C)法提取DNA;(1)取 1.5mL 瘤胃混合液至 beadbeater 管中,16000g, l0min, 4,弃上清。加入 ImL 裂解液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl, pH 8.0, 5

36、0 mM EDTA, 和4%SDS (十六烷基硫酸钠)和0.4 g灭菌的银粉(0.1 mm的0.3 g和0.5 mm的 0.1 g);(2)用Mini-Beadbeate (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)最大振幅,匀质化3min; (3)70C 15min,每隔5min轻轻颠倒摇晃管子;(4)16000g,室温离心5min,取上清转移至2mL离心管中;(5)往beadbeater管中再次加入0.3mL裂解液,重复步骤2-4,将2次的上清液混合;(6)往每管上清液中加入0.26mL10M的醋酸铵,颠倒数次混合均匀,冰浴 5min;(7)16000

37、g, 4 离心 l0min;(8)将上清转移到2个1.5mL的离心管中,再加入等体积异丙醇,混合均匀,冰浴30min;(9)16000g, 4C离心15min,小心倒掉上清,加入0.7mL的70%的乙醇,16000g, 4C离心l0min,弃乙醇,风干沉波(不要太干,乙醇挥发完即可)。(10)然后每管加入50?lOOnLTE 缓冲液(lOmMTris-HCl, ImMEDTA,pH8.0)溶解DNA,再将2管合并。(11)加入2uL 的 RNase (lOmg/mL), 37,15min;（12)加入7uL的蛋白酶K和200uL的AL缓冲液(the QIAamp DNA Stool Mini

38、Kit),混合均勾,70C, l0min;(13)加入200uL的乙醇并混合均勻,再转移至QIAamp柱子中,16000g,离心1min;(14)弃流动相,加入500uL的AW1缓冲液(Qiagen),室温离心Imin;(15)弃流动相,加入500uL的AW2缓冲液(Qiagen),室温离心Imin;(16)将柱子于室温下离心Imin,使柱子晾干;(17)加入l00uL的缓冲液AE(Qiagen)(可先65C预热,以加大DNA洗脱效率),室温下放置2min;(18)取一新1.5mL离心管,放于每个柱子下,室温离心1min。(19)将DNA分装至4个管中,-20C保存,用Nanodrop测定提取

39、的DNA浓度及260/280nm OD比值。1.2.3.2 PCR引物设计参照 Tajima 等(2001 )报道的S. ruminantium 的引物,Denman 和 McSweeney(2006)报道的瘤胃总菌、真菌、flavefaciem、F. succinogenes 的引物,Denman等(2007)报道的原虫引物和Koike和Kobayashi (2006)报道的R.albus引物,引物序列见表2-7,由上海英俊公司合成。表2-7实时定量PCR引物序列Table 2-7 PCR primers for real-time quantitative PCR assayTarget

40、Species Forward Primer sequenceTotal bacterial F CGGCAACGAGCGCAACCCR CCATTGTAGCACGTGTGTAGCCFungi 1 F GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCR CAAATTCACAAAGGGTAGGATGATTProtozoa2 F GCTTTCGWTGGTAGTGTATTR CTTGCCCTCYAATCGTWCTR. flavefaciensl FCGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGGRCGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACCF. succinogenes

41、 1 FGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAR CGCCTGCCCCTGAACTATCR. albus3 F CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCGR CCTCCTTGCGGTTAGAACAS. ruminaniium4 F TGCTAATACCGAATGTTGR TCCTGCACTCAAGAAAGA1 Cited from Denman and McSweeney (2006);2 Cited from Sylvester et al. (2004);3 Cited from Koike and Kobayashi (2001)4 Cited from Tajima et al

42、. (2001).1.2.3.3 RT-PCR反应体系和条件稀释DNA模板至0.5或1 ng/iL,采用RT-PCR方法测定瘤胃原虫、真菌、R flavefaciem和R. albus相对于瘤胃总细菌16S rDNA的量。仪器为美国 ABI 公司的 7500 real-time PCR systems。以 SYBR Premix Ex TaqTM试剂建立20 反应体系,qRT-PCR反应体系见表2-8。按表2-8配置PCRmixture (19|_U反应体系,先不加入模板),每孔分装19ul混合体系加入到96孔板中,再加入1ul模板,组成20ul反应体系,每个模板的不同引物设置三个平行样。用热

43、封膜将96孔板密封,将96孔板低速离心l0min,然后将96孔板置于RT-PCR仪器中,按反应条件图2-2的程序进行。表2-8 qRT-PCR反应体系Table 2-8 Reaction system of qRT-PCRn:所有样品数。不同品质粗饲料日粮中添加异位酸对_省略_指标和生产性能的影响及其机理研究_照日格2.1.1 不同品质单一粗饲料对体外发酵指标的影响研究2.1.1.1.3 试验设计与体外培养底物日粮试验选用品质不同的四种粗饲料，并进行体外批次培养试验。体外培养四种粗饲料分别为：（1）玉米青贮（GI9.05MJ）；（2）苜蓿干草（GI48.71MJ）；（3）羊草（GI9.41MJ

44、）；（4）玉米秸秆（GI1.81MJ）。试验共设 4 个处理组，每组设 3 个重复。四种粗饲料分别取样 0.4g（DM）进行体外 3h、6h、9h、12h 和 24h 培养，以确定四种粗饲料各项体外发酵指标。四种粗饲料 GI 指数计算：GI=ME（Mcal/kg）DMI（kg/d）CP（%DM）/NDF（或 ADL）（%DM）ME粗饲料代谢能；DMI粗饲料干物质随意采食量；CP粗蛋白，占干物质百分比；NDF中性洗涤纤维，占干物质百分比；ADL酸性洗涤木质素，占干物质百分比。粗饲料代谢能的测定 参照张吉鹍（2004）博士论文用 CP 预测 IVDMD（干物质体外消化率）的模型，即ME = DE0

45、.815 = GEIVDMD0.815IVDMD=36.3561+1.9727CP-0.0302（CP）2（R2=0.9087，n=8，P0.0025）粗饲料干物质采食量（DMI）预测公式：参照张吉鹍（2004）94博士论文。苜蓿 DMI（g/d w0.75）=51.26/ NDF（%DM）羊草 DMI（g/d w0.75）=45.00/ NDF（%DM）玉米秸秆 DMI（g/d w0.75）=29.75/ NDF（%DM）玉米青贮 DMI（g/d w0.75）=29.00/ NDF（%DM）2.1.1.1.4 测定指标样品在水浴摇床上进行连续培养3h、6h、9h、12h和24h，分别测定气体产量，采集培养液直接测定pH值，用双层纱布滤去大块饲料残渣，再取滤液，滤液经4000rpm离心15min，用移液管移取上清液0.5m1置于预先装有4.5m1 0.2M盐酸的采样瓶中，摇匀用来测定NH3-N浓度；再移取4m1上清液加到