分子标记技术及其应用_ISSR

1、ISSR分子标记及其在果树遗传学的应用果树学 刘志发主要内容 ISSR分子标记 ISSR分子标记的基本原理和特点 ISSR分子标记实验操作 ISSR分子标记在果树遗传学的应用 问题与展望ISSR分子标记 ISSR分子标记是在SSR分子标记基础上发展起来的一种DNA多态性检测技术。即锚定简单重复序列（anchored simple sequence repeat，ASSR），也称作简单重复间序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记技术或以微卫星为引物的PCR(microsatellite primed PCR,MP-PCR) 。 它是由加拿大蒙特里尔大学的Z

2、ietkiewicz等1994年提出的 。ISSR分子标记的基本原理和特点 基本原理 特点在真核生物基因组中均存在着由14个核苷酸组成的简单重复序，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因组中最多的SSR 是(AT)n、(TA)n、( GA)n、(CT)n等二核苷酸重复序列。ISSR技术的基本原理就是在用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3端或5端加上24个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。锚定锚定ISSR-PCR示意图示意图5锚定引物锚定引物NNNN(CA)n3锚定引物

3、锚定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5锚定引物锚定引物NNNN(CA)n3锚定引物锚定引物NN(CA)n3锚定引物的锚定引物的PCR产物产物5锚定引物的锚定引物的PCR产物产物用重复序列用重复序列(CA)n作单引物，在引物的作单引物，在引物的5端或端或3锚定锚定1至数个碱基。至数个碱基。实验操作简单、快速、高效，实验操作简单、快速、高效，DNADNA用量少用量少, ,引引物设计容易物设计容易, ,实验成本低廉。实验成本低廉。I

4、SSRISSR遗传多态性高，重复性好。遗传多态性高，重复性好。符合孟德尔遗传规律。符合孟德尔遗传规律。无需知道任何靶标序列的无需知道任何靶标序列的SSRSSR背景信息。背景信息。 优点：优点：PCRPCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸扩增反应的最适条件需要一定时间摸索。索。ISSRISSR标记大多是显性标记，不能区分显标记大多是显性标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。性纯合基因型和杂合基因型。 缺点缺点ISSR分子标记实验操作 DNA样品的提取 引物设计 PCR扩增反应 PCR产物的电泳及数据分析DNA样品的提取 提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子标记的DNA样品的提取方法有

5、： SDS法 CTAB法引物设计 引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。用于ISSR的引物常为5端或3端加锚的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数一般为48次，使引物的总长度达到20bp左右。5端或3端用于锚定的碱基数目一般为14个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配SSR的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。PCR扩增反应反应体系 模板DNA dNTP 引物 Taq DNA聚合酶 PCR反应缓冲液 扩增步骤 变性（denaturation） 退火（anealing） 延伸(extension)PCR产物的电泳与数据分析 PCR产物需经电泳分

6、离、染色显示后才能进行条带观察、统计。 目前可用于ISSR扩增产物分离的电泳有：浓度为1.5%2.0%琼脂糖凝胶电泳或浓度为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，后者的分离效果通常更好。用溴化乙锭(EB)或硝酸银染色后，在紫外光或可见光下进行观察，统计带纹的有(计为1)或无(计为O)及相对位置，然后即可根据研究目的，应用UPGMA、SPSS等聚类分析软件进行分析。ISSR分子标记技术在果树遗传学的应用 遗传多样性和居群遗传结构遗传多样性和居群遗传结构 种质资源鉴定与亲缘关系种质资源鉴定与亲缘关系 遗传指纹图谱的构建遗传指纹图谱的构建 遗传多样性 彭瑜等利用ISSR分子标记方法对20个柚类品种进行遗传多样性研

7、究，揭示了柚类品种间丰富的遗传多样性。 邹游等利用ISSR技术对采自四川省猕猴桃科研基地的14个猕猴桃品种进行了遗传多样性分析。ISSR标记说明猕猴桃品种间遗传距离与地理分布有一定关系, 地理位置较近的品种能聚在一起。 徐志祥等ISSR分子标记对南丰柑桔品种的遗传多样性进行研究。从100个ISSR引物中筛选出17个多态引物，对14份柑桔样品进行ISSR-PCR分析。UPGMA聚类分析结果表明，以遗传相似系数为0.67为分界线，可以将14份供试柑桔样品分成三类：第一类包含以ss-28为代表的7个柑桔品种；第二类包含以杨小2,6 为代表的3个柑桔品种；第三类包括以早系97-1 为代表的4个柑桔品种

8、。基于ISSR分析的14份南丰蜜桔UPGMA聚类图种质资源鉴定与亲缘关系 果树生命周期长，并长期通过无性方式繁殖，加上不同地域间的相互引种，使同名异物和同物异名现象十分普遍，如何准确地对现有果树品种鉴定和亲缘关系分析，是进一步科学、有效地利用果树资源的基础。借助ISSR分子标记技术，可以在大范围内对果树的遗传物质进行较全面的比较，从而对果树种质资源鉴定和亲缘关系分析。 吴兴恩等对富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔资源进行了ISSR分析,并对所得结果进行了讨论，发现采用ISSR技术可作为品种鉴别、亲缘关系和分类的手段之一。 遗传指纹图谱的构建 果树遗传指纹图谱研究技术是在现代仪器分析技术基础上发

9、展起来的, 进而对果树进行鉴定和质量控制。研究方法也有多种, 分别从不同的角度反映了果树的遗传信息。ISSR标记容易发现多态性，敏感性高，通过ISSR分析可以找出与靶基因连锁的ISSR标记。ISSR标记在杂交群体中呈孟德尔式分离，ISSR遍布基因组，多态性高，因此可用于遗传作图。 Sankar等对用ISSR在柑橘作图中效果评价，认为ISSR 标记符合孟德尔式分离，标记是显性标记，少部分标记呈共显性分离， 可以同RFLP、RAPD、同工酶的遗传图谱相互补充，构建新的遗传图谱，因此ISSR适合柑橘的遗传图谱构建。 雷天刚等利用SSR标记和ISSR 标记对102个柑橘栽培品种进行DNA指纹分析，筛选适合的特征引物，构建柑橘栽培品种的指纹图谱数据库。问题与展望 ISSR标记因其引物容易设计，实验重复性强，操作过程简单，不须使用同位素，可以揭示更高程度的DNA多态性，从而在果树遗传研究中具有广阔的应用前景，但任何一种分子标记都不能解决所有问题，在今后的研究