第2章 工业微生物的菌种选育

1、一、工业微生物的特点一、工业微生物的特点v个体小个体小v种类多种类多v繁殖快繁殖快v分布广分布广v代谢能力强代谢能力强v易变异改造易变异改造第一节第一节 概述概述二、发酵工业对菌种的要求二、发酵工业对菌种的要求v 1.生产力： 能在能在廉价的培养基廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的上迅速生长，代谢产物的产量高产量高，其它代谢产，其它代谢产物少物少v 2.操作性： 发酵条件易控制，发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途径尽可能地简单），径尽可能地简单），产品易分离产品易分离v 3.稳定性： 抗杂菌和抗杂菌和抗噬菌体能力强抗噬菌体能力强，遗

2、传性状稳定，菌种不易变异退化，遗传性状稳定，菌种不易变异退化v 4.安全性： 是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素第一节第一节 概述概述三、菌种选育的目的三、菌种选育的目的v1、提高发酵产量、提高发酵产量v2、改进菌种的性能、改进菌种的性能v3、产生新的发酵产物、产生新的发酵产物v4、去除多余的组分、去除多余的组分第一节第一节 概述概述v（一）菌种选育的理论基础（一）菌种选育的理论基础v（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程四、菌种选育的基本理论四、菌种选育的基本理论第一节第一节 概述概述（一）菌种选育的理论基础（一）菌种选育的理论基础v遗传和变异遗传

3、和变异 基因突变基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。生的遗传性状的变异。前突变：前突变：诱变剂所造成的诱变剂所造成的DNADNA分子的某一位置的结构改分子的某一位置的结构改变称为前突变。变称为前突变。影响前突变产影响前突变产生的的因素生的的因素细胞对诱变剂的透性细胞对诱变剂的透性细胞质和酶的影响细胞质和酶的影响基因所处的状态基因所处的状态1 1、前突变形成、前突变形成（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程1 1）光复活作用）光复活作用2 2）切补修复）切补修复3 3）重组修复）重组修复4 4）SOSSOS修复系统（多数诱变来源于此）

4、修复系统（多数诱变来源于此） 5 5）DNADNA多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用2 2、DNADNA损伤的修复损伤的修复（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程SOS修复系统修复系统 它允许新生的它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。 （二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程校正差错：校正差错：光复活作用、切补修复光复活作用、切补修复引起差错：引起差错：重组修复、重组修复、SOS

5、SOS修复系统。修复系统。3 3、从前突变到突变、从前突变到突变（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程表型迟延：表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变表型的改变落后于基因型的改变分离型迟延分离型迟延 ( (基因杂合基因杂合) ) 经诱变处理后，细胞中的基因处于经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。其性状才得以表达。生理性迟延生理性迟延新的表型必须等到原有基因的产物新的表型必须等到原有基因的

6、产物稀释到某一程度后才能表现出来稀释到某一程度后才能表现出来。4 4、从突变到突变型、从突变到突变型（二）突变诱发的过程（二）突变诱发的过程v从菌种保藏中心购买从菌种保藏中心购买v育种育种 从自然界中筛选从自然界中筛选 诱变诱变 杂交育种杂交育种 基因工程育种基因工程育种 四、菌种来源四、菌种来源第一节第一节 概述概述CGMCCv 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center）成立于）成立于1979年，是以提供专业年，是以提供专业技术服务为主的

7、公益性机构，技术服务为主的公益性机构，1995年获得布达佩斯条约年获得布达佩斯条约国际保藏中心的资格，是我国唯一同时提供一般菌种资国际保藏中心的资格，是我国唯一同时提供一般菌种资源服务和专利生物材料保存的国家级保藏中心。中心设源服务和专利生物材料保存的国家级保藏中心。中心设立在中国科学院微生物研究所。立在中国科学院微生物研究所。v一、定义一、定义v二、方法二、方法v三、特点及应用三、特点及应用第二节第二节 自然选育自然选育自然选育：自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的根据菌种的自发突变自发突变而进行菌种筛选的过程。而进行菌种筛选的过程。自发突

8、变：自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。所发生的那些突变。一、定义一、定义多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应互变异构效应互变异构效应第二节第二节 自然选育自然选育二、菌种自然选育方法二、菌种自然选育方法单菌落分离法单菌落分离法菌种菌种单细胞悬液单细胞悬液琼脂板分离琼脂板分离挑取单菌落挑取单菌落测定生产能力测定生产能力细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤第二节第二节 自然选育自然选育v三、特点及应用三、特点及

9、应用 简单易行、自发突变的效率低。简单易行、自发突变的效率低。 纯化菌种，防止纯化菌种，防止菌种衰退菌种衰退、稳定产量和提高产、稳定产量和提高产量量第二节第二节 自然选育自然选育1、目前生产用菌种的特点、目前生产用菌种的特点 多为人工诱变而来。多为人工诱变而来。 代谢调控系统失控。代谢调控系统失控。 生活力比野生菌株弱。生活力比野生菌株弱。 容易发生变异。容易发生变异。菌种衰退原因的分析菌种衰退原因的分析2、菌种遗传特性的改变、菌种遗传特性的改变1 1）异核现象）异核现象-导致菌种这一微生物群体发生变异导致菌种这一微生物群体发生变异2 2）自发突变）自发突变3 3）回复突变或产生分离子）回复突

10、变或产生分离子-形成具有不同基因型的形成具有不同基因型的个体个体异核体异核体孢子遗传特性和孢子遗传特性和生长速度不同生长速度不同菌种遗传特性发生改变菌种遗传特性发生改变相邻菌丝细胞吻合相邻菌丝细胞吻合回复突变：回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回复突变。复突变。1 1）一个菌种不是纯一的群体。）一个菌种不是纯一的群体。3、菌种生理状态的改变、菌种生理状态的改变2 2）培养基营养成分的影响）培养基营养成分的影响3 3）某些）某些培养条件培养条件下，某些基因所处的状态不同，下，某些基因所处的状态不同，使得菌种的生理状态不

11、同。使得菌种的生理状态不同。主要是因为培养条件不适当。主要是因为培养条件不适当。v一、定义及特点一、定义及特点v二、诱变剂二、诱变剂v三、诱变育种的主要环节三、诱变育种的主要环节第三节诱第三节诱 变变 育育 种种第三节诱第三节诱 变变 育育 种种v诱变育种：诱变育种： 通过通过诱变剂处理诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良特性的变异菌株的方法。特性的变异菌株的方法。v特点：特点： 速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。第

12、三节诱第三节诱 变变 育育 种种v物理诱变剂：射线如紫外线、物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、射线、-射线，射线，快中子；快中子；v化学诱变剂：氮芥、化学因子如碱基类似物、化学诱变剂：氮芥、化学因子如碱基类似物、 5-氟尿嘧啶、亚硝酸、亚硝基胍等。氟尿嘧啶、亚硝酸、亚硝基胍等。v生物诱变剂：溶原性噬菌体，人工构建的质粒、生物诱变剂：溶原性噬菌体，人工构建的质粒、转座子转座子第三节诱第三节诱 变变 育育 种种突变的诱发突变的诱发突变株的筛选突变株的筛选突变高产基因的表现突变高产基因的表现v1.1.出发菌株的选择出发菌株的选择v2.2.诱变处理诱变处理v3.3.筛选筛选v4.4.突变菌株高产基因

13、的表达突变菌株高产基因的表达第三节诱第三节诱 变变 育育 种种v选择纯种菌株（排除异核体）选择纯种菌株（排除异核体）v优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）v对诱变剂敏感的菌株对诱变剂敏感的菌株v同时选择几株不同的优良菌株同时选择几株不同的优良菌株1.出发菌株的选择出发菌株的选择v1）2.诱变处理诱变处理v高剂量：致死率高剂量：致死率90%-99.9% 变异幅度大，但负变株多v低剂量：致死率低剂量：致死率75%-80% 负变株少，且突变菌株稳定3.筛选筛选v 根据步骤可以分为初筛和复筛根据步骤可以分为初筛和复筛v 初筛初筛 菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗

14、放些，采用一个菌种菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗放些，采用一个菌种进一个摇瓶的方法进行初筛进一个摇瓶的方法进行初筛v 复筛复筛 对发酵和测试条件要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进对发酵和测试条件要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进35个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复筛选几次。个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复筛选几次。v 初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。v 复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件养条件v根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛选根据操作方

15、法可分为随机筛选和理性化筛选q 随机筛选随机筛选q 理性化筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如营养缺陷型、行有的放矢的筛选。如营养缺陷型、抗性突变株等。抗性突变株等。经过诱变处理后，进行平板分离，随经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株机挑选单菌落，筛选高产菌株1 1）摇瓶筛选法）摇瓶筛选法单菌落单菌落传种斜面传种斜面模拟发酵瓶模拟发酵瓶测定发酵能力测定发酵能力2 2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法打孔取块打孔取块 鉴定平板测定发酵能力鉴定平板测定发酵能力 ( (须经摇瓶复筛须经摇瓶复筛) )随机筛选随机筛选3 3）

16、筛选自动化和筛选工具微型化）筛选自动化和筛选工具微型化96孔板高通量孵育筛选孔板高通量孵育筛选营养缺陷型菌株筛选理性化筛选理性化筛选 所谓所谓营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产是微生物经诱变剂处理后产生的一种生的一种生化突变体生化突变体。由于基因突变，它。由于基因突变，它失去了合成某失去了合成某种物质种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上本培养基上不能生长不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。一定种类的有机物质后才能生长。1 ）筛选用培养基）筛选用培养基2

17、）营养缺陷型菌株筛选的一般方法）营养缺陷型菌株筛选的一般方法 v 将突变菌株放到完全致死的环境中，一次性筛出抗性将突变菌株放到完全致死的环境中，一次性筛出抗性突变株。突变株。v 包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：抗生素抗性突变：提高产量；提高产量； 抗噬菌体突变：抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；消除噬菌体污染； 条件抗性突变：条件抗性突变：如温度，可提高产量；如温度，可提高产量；抗性突变株筛选抗性突变株筛选v培养基培养基v发酵条件发酵条件4.突变菌株高产基因的表达突变菌株高产基因的表达v 制备菌悬液制备菌悬液 细菌要处于对数生长期，此时，生

18、长状态同步，生细菌要处于对数生长期，此时，生长状态同步，生理活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。理活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。v 保证菌悬液均匀保证菌悬液均匀 用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。v 维持一定的细胞浓度维持一定的细胞浓度 真菌和酵母一般是真菌和酵母一般是106-107个个/毫升，放线菌和细毫升，放线菌和细菌是菌是10 8个个/毫升。毫升。举例（紫外线育种）举例（紫外线育种）v 诱变诱变 单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将培单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将培养皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖，养

19、皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖，打开紫外灯，计时。打开紫外灯，计时。v 培养培养 达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。诱变最有效的波长是波长是260 nm左右（左右（253265nm ），），紫外灯的功率为紫外灯的功率为15W，距离固定在距离固定在30 cm左右。左右。v一、定义和特点一、定义和特点v二、原理二、原理v三、常规的杂交育种：准性生殖方式杂交三、常规的杂交育种：准性生殖方式杂交v四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术第四节第四节

20、杂杂 交交 育育 种种 技技 术术杂交育种杂交育种 一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。状的菌株。一、定义和特点一、定义和特点v 定向定向v 杂交后对诱变剂敏感杂交后对诱变剂敏感消除诱变效应饱和消除诱变效应饱和v 改变产品质量和产量改变产品质量和产量v 操作复杂，技术要求高，推广和应用受限操作复杂，技术要求高，推广和应用受限特点特点二、原理二、原理1.理论基础理论基础2.重组与杂交的关系重组与杂交的关系v 重组重组分子水平，杂交分

21、子水平，杂交细胞水平细胞水平v 杂交中必然包含着重组；杂交中必然包含着重组；v 重组则不限于杂交这一形式。重组则不限于杂交这一形式。(一一)遗传标记遗传标记 所谓所谓营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产是微生物经诱变剂处理后产生的一种生的一种生化突变体生化突变体。由于基因突变，它。由于基因突变，它失去了合成某失去了合成某种物质种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上本培养基上不能生长不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。一定种类的有机物质后才能生长。 营养标记

22、菌株（营养标记菌株（营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株）是最常用的）是最常用的遗传标记之一。遗传标记之一。三、常规的杂交育种三、常规的杂交育种( (二二) )异核体形成异核体形成( (三三) )杂合二倍体的形成杂合二倍体的形成* *提高异核二倍体的培养温度提高异核二倍体的培养温度* *用紫外线照射异核体用紫外线照射异核体特点：特点：体积、体积、DNADNA含量明显大于直接含量明显大于直接亲本；具有较高的酶活性，生长速率亲本；具有较高的酶活性，生长速率和糖的利用率较快。和糖的利用率较快。提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：（四）重组（四）重组 v1染色体交换染色体交

23、换 发生在体细胞的有丝分裂过程中。发生在体细胞的有丝分裂过程中。 特点：形成的两个子细胞仍为双倍体细胞，但基因型特点：形成的两个子细胞仍为双倍体细胞，但基因型不同。不同。v2染色体单倍化染色体单倍化基因重组基因重组甲甲生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高应用应用 面包面包酵母酵母: :对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 COCO2 2 多，生长快；多，生长快； 酒精酒精酵母酵母: :产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱力弱 杂交杂交: :就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌就得到了既能生产酒精，又

24、能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。四、原生质体融合四、原生质体融合 用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（制成原生质体，再用聚乙二醇（PEGPEG）促进）促进原生质体融合，从而获得异核体或重组子，原生质体融合，从而获得异核体或重组子，这一技术叫这一技术叫原生质体融合原生质体融合。（一）原生质体融合育种步骤（一）原生质体融合育种步骤1.1.标记菌种的选择标记菌种的选择 一般以营养缺陷型和抗药性等遗传形状作为标，且标一般以营养缺陷型和抗药性等遗传形状作为标，且标记必须稳定。记必须稳定。

25、2.2.原生质体的制备原生质体的制备 在在放线菌和细菌放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用中，制备原生质体主要采用溶菌酶溶菌酶；酵母和霉菌酵母和霉菌一般可用一般可用蜗牛酶或纤维素酶蜗牛酶或纤维素酶等。等。1 1）菌体的前处理（）菌体的前处理（EDTAEDTA、青霉素）、青霉素）2 2）菌体的培养时间）菌体的培养时间4 4）酶处理温度）酶处理温度3 3）酶浓度）酶浓度6 6）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、KClKCl）5 5）酶解时间）酶解时间 3.3.原生质体融合原生质体融合在融合剂在融合剂PEGPEG和和CaCa2+2+作用下，发生原生质体融合。作用下，发生原生质体融合。 4.4.原生质体的再生原生质体的再生再生培养基再生培养基- -由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。 5.5.融合子的选择融合子的选择要获得真正融合子，必须在融合体再生后，进行要获得真正融合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。几代自然分离、选择，才能确定。1.单一亲