基因工程第八章克隆基因的表达

1、人粒细胞集落刺激因子 Lac启动子遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程中心法则中心法则（central dogma）。）。 外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E. coli 原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所

2、有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。成一个表达的协同单位。2. 以操纵子为单位以操纵子为单位1. 只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶有意义链有意义链5 反意义链反意义链3 转录转录mRNA5 3 翻译翻译蛋白质蛋白质NC5 3 4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5. 调控主要在转录水平上。调控主要在转录水平上。原核生物中起始密码子原核生物中起始密码子AUG上游上游712个核个核苷酸序列因其与苷酸序列因其与16SrRNA 3末端反向互补末端反向互补而被认为在核糖体而被认为在核糖体-

3、mRNA的结合过程中起的结合过程中起作用，叫作用，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6. mRNA具有具有核糖体结合位点核糖体结合位点SD序列序列 外源基因不能带有内含子。外源基因不能带有内含子。2. 真核生物不能用基因组真核生物不能用基因组DNA ，必须用，必须用cDNA 。3. 必须利用原核细胞的调控元件（启动子等）必须利用原核细胞的调控元件（启动子等）4. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致大肠杆菌的所

4、有启动子中都有两段一致顺序（顺序（consensus sequence）。 1. 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box（1） 启动子序列启动子序列 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5 核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点 。核糖体结合位点（核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ribosome binding sitemRN

5、A 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。全酶是一个全酶是一个5 5聚体，含有两个聚体，含有两个小亚基小亚基，和，和2 2两个大亚基（两个大亚基（和和），一个），一个亚基。亚基。 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。（1 1）结构）结构内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有位置有一段

6、一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。段转录终止子。启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。延续。 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了数

7、降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNAmRNA折叠折叠 U CU CC C U GU GGCGCAUAUCGCGCGCGGCGCCGCGCGCGGCGCA A A A CCCAC UUUU3 CCCAC UUUU3 DNARN

8、A聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上。一般安置上全部的三个全部的三个终止密码终止密码UAA，UAG，UGA，防止核糖体跳防止核糖体跳跃（跃（skipping）。）。Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）; 大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR（非翻译区）（非翻译区）中富含中富含U的区段。的区段。 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细

9、胞能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的总蛋白的10%-30%以上。以上。 应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。来自大肠杆菌的来自大肠杆菌的乳糖操纵子。乳糖操纵子。用乳糖或其类似用乳糖或其类似物物IPTG充当诱导充当诱导物，与阻遏蛋白物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。结合，解除抑制。Plac O目的基因目的基因四聚体的四聚体的阻遏物阻遏物单体的阻遏物单体的阻遏物阻遏物作用区阻遏物作用区 CAP作用区作用区 cAMP +CRP= CAPRNA聚合酶作用区聚合酶作用区组成：组成：长度

10、：长度：205bp的的HaeIII片段片段 （包括（包括-半乳糖苷酶的前半乳糖苷酶的前8个密码）。个密码）。IPTGIPTG有毒、昂有毒、昂贵贵Sigma 636.00元元 /gIPTG =异丙基硫异丙基硫代代-D半乳糖半乳糖 人粒细胞集落刺激因子 人粒细胞集落刺激因子 重组大肠杆菌染色体 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；操纵基因； 衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。色氨酸合成相关基因色氨酸合成相关基因5个，编码个，编码3种酶。种酶。trpRP1O trpEt

11、rpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲 酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油 硼酸合成酶硼酸合成酶色氨酸色氨酸 合成酶合成酶 链链 链链 分支酸分支酸邻氨基邻氨基 苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘 油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录（P1P1是主要启动子，是主要启动子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）没有色氨酸没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。苯氨基磷酸脱氧核酮糖苯氨基磷酸脱氧核酮糖 trpRP1O trpEtrpD

12、P2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般还附带操纵基因、启动子一般还附带操纵基因、和部分和部分trpE基因。基因。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录。录。 （色氨酸称为（色氨酸称为corepressor辅阻遏物）辅阻遏物）是从是从 噬菌体中得到的一类启动子，比噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动启动子的活性高子的活性高8-10倍，比倍，比trp启动子活性高。启

13、动子活性高。 cIII NPL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗终止蛋白；抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；阻遏蛋白； P:启动子；启动子；O:操纵子。操纵子。R:右；右；L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物转录转录转录转录转录转录当当cI合成后，与合成后，与OL和和OR结合阻止结合阻止RNA聚合聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使使cI进一步转录。进入溶原期。进一步转录。进入溶原期。 早期左边早期左边早期右边早期右

14、边表达载体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的则是选择了一个温度敏感性的突变基因突变基因cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。44-45oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录PL外源基因外源基因32oC时阻遏时阻遏PL，外源基因不转录。，外源基因不转录。1. 细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白不溶性蛋白质质聚集折叠而成的晶体结构物。聚集折叠而成的晶体结构物

15、。形成原理未知。形成原理未知。例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。 缺点缺点 优点优点（1）周质（）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚机理目前不完全清楚优点：优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-

16、内酰胺酶（内酰胺酶（lactamase）、）、 肠毒素（肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。要正确切割掉。（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）一般位于一般位于N N端。端。鼠源鼠源RNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。也能在细菌中起作用。胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucan

17、ase）。）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。太理想。用用溶血素溶血素（hemolysin）基因构建分泌性）基因构建分泌性融合蛋白；融合蛋白；溶血素溶血素(hemolysin)是一种可使红血球细胞溶解的毒是一种可使红血球细胞溶解的毒素素(cytolytic toxin)。在许多病原菌被证明与致病相关。在许多病原菌被证明与致病相关。 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（b

18、acteriocin release protein)共表达。共表达。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG优点优点1. 非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。实验室建立的。表达能力强。表达能力强。组成结构：组成结构： 强启动子强启动子: tac（trp-lac）:trp的的-35区

19、区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因操纵基因：操纵基因：乳糖操纵子系统。乳糖操纵子系统。终止子：终止子：调节基因：调节基因：Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如如JM105菌。菌。rrnB（rRNA操纵子的强终止子）操纵子的强终止子）S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分：载体的其余部分：来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物：表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物阻

20、遏物IPTG必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。条件：条件：载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。质中。如：如：pIN III系列：系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构）组成结构Ipplac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。调节基因：调节基因：lac I S-D序列和起始密码序列和起始密码

21、ATG。 分泌信号肽：分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克隆位点）。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：强启动子：以以pBR322为为基础构建的。基础构建的。 调节基因不必调节基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。体上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：启动子：tac 操纵基因：操纵基因：lacP 调节基因：调节基因：lacI S-D序列序列（1）优点）优点（2）组成结构）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。lacItac lac

22、O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝谷胱甘肽琼脂糖凝胶胶(Glutathione Sepharose)亲和层析柱亲和层析柱分分离纯化。离纯化。用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽巯基转移酶GST上切下来。上切下来。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用插入区：插入

23、区：pGEX-1 TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽巯基转移酶CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG A

24、TC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子因子pGEX-2X的插入区：的插入区：pGEX-3X的插入区：的插入区：Sma ISma IHis-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸（His）。）。His-tag序列可与带二价正电的阳离子相序列可与带二价正电的阳离子相螯，螯，His-tag能与能与Ni2+ +柱柱结合，但很容易结合，但很容易被被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可（或咪唑

25、溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。以纯化蛋白质。溴化氰溴化氰Cyanogen bromide：由于半乳糖苷酶可以和其底物类似物ABTG结合，但不能使之分解，因此可以ABTG为配体进行亲和层析纯化融合蛋白。 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）1. 启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3） -35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-T

26、TGACA TATAAT 一致顺序一致顺序lactrp PL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基： 如果是如果是A（T）, 翻译效率最高；翻译效率最高； 如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。（1）S-D序列序列？AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA

27、中：中： AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最时，最为有效；为有效； 如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。3. 启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离转录终止区的存在保证载体转录终止区的存在保证载体不会转录非必须不会转录非必须基因基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。数目。增加表达效率。5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋白

28、在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等2. 调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子一般为一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。4. 增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复性基因

29、外重复性基因外回文序列回文序列”能防止能防止mRNA受到受到35外外切酶的攻击。切酶的攻击。5. 减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动子，启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外启动子启动，外源基因高水

30、平表达，宿主生长受到限源基因高水平表达，宿主生长受到限制。制。cI857PL外源基因外源基因PO调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。始终产生阻遏物。无无IPTG:阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。源基因转录。宿主大量生长。有有IPTG:阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。抑制。将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量当宿主大量生长后生长后，再诱导载体质粒的

31、，再诱导载体质粒的复制，增加拷贝数。复制，增加拷贝数。当需要宿主大量当需要宿主大量生长时生长时，抑制载体质，抑制载体质粒的复制。粒的复制。C37CN末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割6. 提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。 ZUV5载体载体:lac ZG AATTCCTTAA G外源基因外源基因 Z2载体载体:lac ZGGG AATTCCCCTTAA

32、 G外源基因外源基因 Z3载体载体:lac ZGG AATTCCCTTAA G外源基因外源基因提供三种融合插入阅读框。提供三种融合插入阅读框。使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶基因突变也减少蛋白酶的降解作用。的降解作用。 T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把白酶。可把pin增加到载体上。增加到载体上。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色

33、体“外排外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa 。真核与原。真核与原核的结构相似核的结构相似, 功能相似，可以互换。功能相似，可以互换。 碱性氨基酸碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区切割位点切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶信号肽酶外源蛋白外源蛋白 有信号肽。有信号肽。 细胞内的转运机制。细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表

34、达；很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种多种蛋白质的参与。蛋白质的参与。 蛋白质蛋白质内内有与有与分泌相关的分泌相关的aaaa 序列。序列。 为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。colE ori lacI intein CBD MCS T7Promotor AmprM13 ori rop 维持拷贝数维持拷贝数pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12 几丁质结合区域几丁质结合区域1. pTYB1，pTYB2: intein在在C端端内含肽内含肽内含肽内含肽内含肽内含肽内含肽内含肽

35、内含肽内含肽Intein与与Chitin柱结合柱结合DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)或或-巯基乙醇或半巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导内含肽胱氨酸能够诱导内含肽Intein的自我的自我裂解活性裂解活性单柱一步纯化蛋白。单柱一步纯化蛋白。无需蛋白酶作用即可将无需蛋白酶作用即可将目的蛋白从融合蛋白分目的蛋白从融合蛋白分离离 IPTG诱导的诱导的T7启动子启动子分离纯化出天然蛋白，分离纯化出天然蛋白，不带有载体蛋白残基。不带有载体蛋白残基。分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1. 形成正确的二硫键形成正确的二

36、硫键 抗体分子抗体分子人血红蛋白分子人血红蛋白分子亚铁血红素如信号肽、内含肽（如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。（1 1）O-糖基化（糖基化（Ser, Thr）糖基糖基（2）N-糖基化（糖基化（Asn）Dol：长醇：长醇Mannose：甘露糖：甘露糖Glucose：葡萄糖：葡萄糖 N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖甲基化、羰基甲基化、羰基化、磷酸化、化、磷酸化、乙酰化、硫酸乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、化、丙烯酸化、豆冠酸化、软豆冠酸化、软脂化脂化羟脯氨酸羟脯氨酸甲基组氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白质的加缺乏蛋白质的加工。工。 （

37、如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修饰等）。基酸修饰等）。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因 能在能在E.coli中克隆和扩增。中克隆和扩增。1. 酵母克隆载体酵母克隆载体Leu2+ +、His+ +、Ura3+ +、Trp1+ +; 有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记有酵母的选择标记Ori 有有大肠杆菌的选择标记大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast)

38、cells由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选片段（选择标记）构成。择标记）构成。ColE1 酵母酵母Leu 2+ +如如 PYeleu10:转化率低（转化率低（110转化子转化子/微克微克DNA）。）。载体上只有细菌的复制区，没有载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。酵母的自主复制区。可与受体细胞的染色体可与受体细胞的染色体DNA同源重组，同源重组，随染色体一起复制。随染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制不能在酵母细胞中自主复制整合到酵母的染色体上整合到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵

39、母的DNA片断片断(选择标记选择标记和酵母和酵母DNA自主复制顺序自主复制顺序ARS）构成。）构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 酵母酵母ARS 酵母选择标记酵母选择标记 ARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守区保守区转化率高（转化率高（102-103转化子转化子/微克微克DNA) 。不稳定，容易丢失。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。细胞中自主复制。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vec

40、tor）在在YRp质粒中插入酵母染色体的质粒中插入酵母染色体的着丝粒着丝粒区区。特点：特点：YRp质粒质粒 酵母着丝粒酵母着丝粒不易从细胞中提取。不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。行为像染色体，能稳定遗传。 单拷贝存在。单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2 m质粒质粒及酵母染色体及酵母染色体DNA选择标记构成。选择标记构成。 大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒酵母选择标记酵母选择标记 2 m质粒质粒如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+ +酿酒酵母的内源质粒，长度是酿酒酵母的内源质粒，长度是2 m 。含有自主。含有自主复制起始区复制起始区ori和和STB序列（使质粒在

41、供体中维序列（使质粒在供体中维持稳定）。持稳定）。(1)它们是封闭环状的双链它们是封闭环状的双链DNA分子，周长约分子，周长约2m(6kb左左右右)，以高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因，以高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含组含60-100个拷贝，约占酵母细胞总个拷贝，约占酵母细胞总DNA的的30%； (2)各含约各含约600bp长的一对反向重复顺序；长的一对反向重复顺序； (3)由于反向重复顺序之间的相互重组，使由于反向重复顺序之间的相互重组，使2m质粒质粒 在在细胞内以两种异构体细胞内以两种异构体(A和和B)形式存在。形式存在。 (4)该质粒只携带与复制和重组有关的该质粒只

42、携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因个蛋白质基因(REP1、REP2、REP3和和FLP)，不赋予宿主任何遗传表，不赋予宿主任何遗传表型，属型，属隐蔽性质粒隐蔽性质粒。2 m质粒特点质粒特点很高的转化活性（很高的转化活性（103-105转化子转化子/微克微克DNA）。）。拷贝数多（拷贝数多（25-100拷贝拷贝/细胞）。细胞）。 比比YRp稳定。稳定。2 m oripMB1 oriLeu- - 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色体上，整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内或独立在酵母细胞内转化转化Leu营养营养缺陷型缺陷型 培养基培养基筛选筛选转化子克

43、隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提取提取插入外源基因插入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、纯化分离、纯化 （1）优点）优点 对其遗传学和生理学的研究比较深入。对其遗传学和生理学的研究比较深入。 小量培养和大规模反应器中都能生长。小量培养和大规模反应器中都能生长。 已经分离出很强的启动子。已经分离出很强的启动子。 有有翻译后的加工翻译后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。化。 安全性高（安全性高（FDA确认的安全生物），不确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。需要宿主的安全性检验。美国食

44、品和药物管理局(Food and Drug Administration)简称FDA 常常发生质粒丢失。常常发生质粒丢失。 重组蛋白常常超糖基化重组蛋白常常超糖基化表达量普遍低。表达量普遍低。每个每个N-寡糖链上含有寡糖链上含有100多个甘露糖，多个甘露糖，分泌困难。分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-138-13个甘露糖。个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在分泌型蛋白有时会留在壁膜壁膜间隙，间隙，（1）细胞质内表达）细胞质内表达 例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：超氧化物超氧化物H+ +H2O2H2O过氧化物酶过氧化物酶表达出的表达出的SOD修

45、饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉， 第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )宿主：宿主： 亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD： 甘油醛磷甘油醛磷酸脱氢酶酸脱氢酶在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：方法：在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Ly

46、s(赖氨酸）赖氨酸）-Arg（精氨酸）（精氨酸）相连。相连。前导肽（前导肽（leader peptide）：）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶内切蛋白酶识别这个切点信号，把重识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。组蛋白正确切下来。前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化

47、酶乙醇氧化酶高达胞内高达胞内总蛋白的总蛋白的40%！嗜甲醇酵母（嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1启动子：启动子：乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶组氨酸脱氢酶基因。基因。 Aox1启动子和启动子和3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。：整合到特定染色体的位点序列。诱导物：甲醇。诱导物：甲醇。产量：产量： 9106剂疫苗剂疫苗/240L发发酵罐。酵罐。乙肝表面抗原乙肝表面抗原乙肝表面

48、抗原乙肝表面抗原作为饲料作为饲料添加剂促添加剂促进反刍动进反刍动物消化。物消化。产量：产量：10L，200h连续发连续发酵产出酵产出50g溶菌酶。溶菌酶。乙醇氧化酶乙醇氧化酶基因基因1乙醇氧化酶基因乙醇氧化酶基因11. 杆状病毒（杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：）侵染周期：两种形式两种形式单独病毒粒子形式单独病毒粒子形式病毒病毒 粒子粒子宿主细胞宿主细胞病毒病毒 粒子粒子侵染侵染释放释放病毒病毒 粒子粒子宿主细胞宿主细胞侵染侵染宿主细胞宿主细胞侵染侵染合成多合成多角体蛋白角体蛋白裂解裂解释放释放多面体

49、溶解多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）感染后感染后36-48h，病毒开始合成大量的，病毒开始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白的启动子特别强。 多角蛋白基因可以被替换掉而不影响多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。病毒的繁殖。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体

50、。成多面体。通过显微镜检查看是否有多面体形成。通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的多角蛋白的启动子特别活跃启动子特别活跃。（1 1）转移载体的构建转移载体的构建大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒，插入两段，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。序列以供同源重组。杆状病毒的基因组太大（杆状病毒的基因组太大（13kb环状环状DNA），），不能直接插入。不能直接插入。必须使用同源重组的办法。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及多角蛋白的启动子和终止子及polyA加加尾信号。尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点启动

51、子与终止子之间插入多克隆位点 转移载体中插入外源基因转移载体中插入外源基因 转移载体与野生型转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转共同转染宿主细胞染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重天后即可收获重组蛋白。组蛋白。杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为源蛋白，成为“低成本蛋白工厂低成本蛋白工厂”。 2222只粉只粉蚊夜蛾幼虫蚊夜蛾幼虫4 4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼天后表达的人腺苷酸脱氢酶占

52、幼虫总蛋白的虫总蛋白的2%-5%2%-5%。共产出。共产出9mg9mg很纯的产物。很纯的产物。（1）寿命短）寿命短感染感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低）共同转染率低重组率更低。重组率更低。0.1%-1%。利用利用AcMNPV的一个早期基因的一个早期基因IE1的启动子。的启动子。 IE1基因的转录不依赖于病毒的其他基因产基因的转录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。物，而且在昆虫细胞中表达正常。 把外源把外源基因插入到基因插入到IE1启动子和启动子和IE1终止子之间。终止子之间。构成整合型载体。构成整合型载体。 载体转染宿主细

53、胞后随载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。续表达。载体载体IE1启动子启动子外源基因外源基因IE1终止子终止子载体载体根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时这种质粒会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），所以称时这种质粒会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），所以称此质粒为此质粒为Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid）。）。环状双链环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的相当于细菌染色体的3%-5%）。）。 转移转移DNA，编码

54、冠瘿碱的合成，能随机整，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是是Ti质粒最重要的部分。质粒最重要的部分。左边界左边界右边界右边界生长素生长素 基因基因细胞分裂细胞分裂 素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱 合成合成生长素基因生长素基因:iaaM（tms1）和）和iaaH（tms2）编码合成）编码合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生长激素）的酶（植物生长激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚乙酸吲

55、哚乙酸tmr（ipt）：异戊烯转移酶）：异戊烯转移酶, 催化：催化：二磷酸异戊烯（二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单异戊烯酰嘌呤单磷酸（磷酸（IPA）5-AMPiaaM: 色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶章鱼碱（章鱼碱（octopine)胭脂碱（胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成与丙酮酸缩合成Arg与与 酮戊二醛缩合成酮戊二醛缩合成农杆碱（农杆碱（agropine）冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，冠瘿碱是在冠瘿瘤

56、内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。微生物都不能利用冠瘿碱。Glu 谷氨酸谷氨酸的二环糖衍生物。的二环糖衍生物。决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移， 进入和整合进入和整合。毒性基因（毒性基因（vir）的产物能诱导）的产物能诱导Ti质粒产生质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱质粒脱离后，可与离后，可与vir的产物的产物VIR D2蛋白结合，并蛋白结合，并在在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助下穿过农杆菌蛋白的帮助下穿过农杆菌内

57、膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。膜，最后整合到植物染色体上。单链的单链的3和和5端分别是端分别是左边界左边界和和右边界右边界区区域，含有域，含有25bp重复序列，参与整合。重复序列，参与整合。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 不相容性基因不相容性基因控制控制Ti质粒的不相容性。质粒的不相容性。分别编码代谢这两种冠瘿碱分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。的酶。维持农杆菌生长。（1）第一步）第一步:植物受伤植物受伤植物受伤后能分泌植物受伤后能分泌酚类化合物酚类化合物（如乙（如乙酰丁香酮、

58、酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮），诱导羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的质粒上的毒性基因表达毒性基因表达。（1）第二步）第二步 感染植物感染植物（3）第三步）第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表达）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步）第四步 T-DNA转移转移T-DNA被被vir基因产物切下来，并运送到植基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组

59、中。物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步）第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤（6）第六步）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。乙酰丁香酮、乙酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮羟基乙酰丁香酮根据所编码的冠瘿碱（根据所编码的冠瘿碱（opine），分为），分为（1）章鱼碱（）章鱼碱（octopine)型质粒型质粒（3）农杆碱（）农杆碱（agropine）型质粒）型质粒裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。植物（玉米）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。）能转化多种植物。 （3）

60、强启动子）强启动子5. Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一个强合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。启动子，能启动外源基因的表达。（1）分子量太大（）分子量太大（200kb）！）！ （2）限制性酶切位点太多。）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。再分化。 （4）在大肠杆菌中不能复制。）在大肠杆菌中不能复制。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的加入大肠杆菌的ori和选择标记和选择标记。（6）加上真核生物的）加