兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定

1、兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定一、 实验目的：通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定，进一步熟悉和综合运用各种分离提纯办法，熟练掌握生化实验的基本方法。进一步掌握酶的分离纯化方法，了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。二、 实验内容及实验技术：实验内容：1. 肌酸激酶概况；2. 肌酸激酶的催化机制；3. 肌酸激酶的测活方法pH比色法；4. 肌酸激酶的分离纯化；5. 肌酸激酶的动力学参数测定；6. 肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。实验技术：1. 颈动脉放血杀兔子；2. 机械法粉碎动物材料的方法；3. 盐析、等电点沉淀和有机溶剂变性、热变性除杂蛋白；4.

2、盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK)；5. 乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶；6. -8，12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白；7. 透析法除残余有机溶剂小分子；8. 凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK；9. pH比色法测定酶活性；10. A280光吸收法测定酶浓度；11. 酶的动力学参数（Ka,Vmax）的测定；12. CK的DTNB修饰反应动力学；13. 酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定；14. SDS-PAGE测定亚基的分子质量和CK纯度；15. 凝胶层析测定CK分子质量。三、 实验原理：肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细

3、胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应：肌酸激酶有四种同工酶形式：即肌肉型（）、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，而MiMi型存在于线粒体内膜上。前3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶。细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(creatine phosphaate shuttle)来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体

4、型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位（），线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸（）。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(myofibrils)，肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶（），这样，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化（）。肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。在催化过程中，该酶的

5、最小功能单位是亚基，亚基在二聚体中独立地起催化作用。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子质量为43 000u左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25 %-30 的-螺旋，15 左右的-折叠。肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby 法。该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）：肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H+，其最适pH为7.5-9.0，在此范

6、围内测定H+ 的生成速度，可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的活性，即在597nm波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。在pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。配制方法见试剂部分。测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10ml 酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm处光吸收的变化，每15秒或30秒读一次吸光度值(A597 )，共读取8个数据点，用A597对时间作图，从图中求出每min吸光度值的变化，即

7、A597。并按下式计算酶的比活力（U）： （mol(minmg)）其中：1.3 为吸光度的变化换算成H+的系数。VA =1.0ml (底物溶液)，VB =0.01ml (加入的酶溶液)。C：加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度C的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为 E11cm=8.8。即：四、 试剂：1. KCl：0.01mol/L，200ml。 (0.15g KCl 加水至200ml)2. NH4OH：1.7mmol/L，1000ml。(取0.12ml 浓氨水，加H2O至1000ml) 3. 柠檬酸铵：0.05mol/L，pH9.0，1000ml。(称12.15g 溶于100

8、0ml H2O)4. Tris-HCl：0.1mol/L，pH8.0，1000ml。（称Tris 12.1g，取HCl 23ml，调pH为8.0，加水至1000ml）5. NH4Cl：研细，10g。6. NH4OH：5mol/L，100ml (公用)7. MgSO4：2.0mol/L，pH8.5，20ml。(公用)8. MgAC2：0.07mol/L，pH9.0，100ml。(公用)9. NaOH：0.2，0.5，1.0，2.0，5.0( mol/L )。(公用)10. HAC：0.2mol/L。11. 95% CH3CH2OH（乙醇）12. 粗盐13. 底物溶液的配制：通常一次配制20ml，

9、当天使用。配制方法：取10ml 48mmol/L的肌酸溶液，加入1.0ml 0.1mol/L的MgAC2，2.0ml 0.1的百里酚蓝(称100mg百里酚蓝，加20ml乙醇溶解后再加水60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0的Gly-NaOH 缓冲液，称48mg ATP溶于此溶液，再补加水5.0ml，用0.10.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.82.2）即可。五、 实验步骤：（一）、兔肌肌酸激酶的分离纯化：1. 将兔子化冻后取大腿肌50g，去除结缔组织和神经后剪碎。加200ml 0.01mol/L KCl，用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各

10、粉碎3次以上，每次不超过30s，以防过热。2. 冰浴搅拌提取15-30min，用8000r/min，0，离心10min，弃去沉淀，测上清体积为V1，取样0.5ml。V1=81.0ml。3. 在其余上清中加入研细的NH4Cl至浓度为0.1mol/L（逐滴加入）。加入的NH4Cl的量：MNH4Cl=5.35V1=0.431 g。用5mol/L NH4OH调pH至9.0（最适pH值），冰浴搅拌30min（0）。4. 加入1.5倍V1体积的95冷乙醇，20搅拌2.5h。以热变性法用60%的有机溶剂变性除杂蛋白。1.5V1=121.50ml8， 8000r/min 离心 10min。弃沉淀，测上清液体积

11、为V2，取样0.5ml。V2=155.5ml5. 其余上清液中加入VA ml的2 mol/L MgSO4(pH=8.5)，至终浓度为0.03mol/L。， VA=2.37ml1.5VA=3.55ml再补加1.5 VA体积的95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌30min ，8，8000r/min 离心10min，弃去上清。6. 沉淀加1/10 V1体积的MgAC2 (0.07mol/L，pH=9.0) 溶解悬浮(冰浴)。冰浴搅拌1h后，0，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V3，取样0.5ml。V3=13.2ml7. 其余上清液用0.5-1mol/L NaOH 调pH=8.

12、0。置冰盐浴内缓慢加入VB 体积的95的冷乙醇至终浓度为36。VB的计算式： 本实验中：VB=2.64ml。8. 搅拌30min后，8，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V4，取样0.5ml。V4=14.5ml.9. 其余上清置于冰盐浴中，缓慢加入VC 体积的95的冷乙醇至终浓度为50。VC的计算式： 本实验中Vc=4.06ml。10. 搅拌30min后，8，12000r/min，离心 10 min，弃上清，沉淀溶于4ml pH 9.0 0.05mol/L 的柠檬酸铵溶液，即为V5，取样0.2ml。（以NH4OH调pH值）V5=4.6ml.11. 对此缓冲液透析过

13、夜。透析袋内加液量控制在1/2到1/3左右，最外面加上冰浴，每小时换一次缓冲液，4-5h。12. 再对1.7mmol/L的NH4OH透析，0， 12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V6，取样0.5ml。V6=4.5ml.13. 其余的V6溶液用此NH4OH透析液调蛋白的质量浓度约为5g/L后用恒流泵上样至DEAE-52离子交换层析柱，用0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平。将上样时未被吸附液和冲洗前阶段液体收集，得穿过峰体积，即为V8。取样0.5ml。14. 用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶，收集活性峰（峰管测活），合并得到V7样品

14、，取样0.5ml，其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。l 离子交换柱层析：取约10mL 湿的DE-52阴离子交换纤维素，抽干后在0.5mol/L NaCl-NaOH溶液中浸泡30min ，水洗至中性，在0.5mol/L HCl 中浸泡30min，水洗至中性，在0.5mol/L NaOH 中浸泡30min，水洗至中性抽干，然后再用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡缓冲液浸泡过夜。在本次实验中，我们使用的柱子是做过一次兔肌肌酸激酶分离的旧柱子，所以直接用50ml 1mol/L NaCl上泵洗柱，再用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡缓冲液平衡。最终柱高约

15、4cm。凸形梯度洗脱液体系：C1（混合瓶）：0.01 mol/L，pH8.0，Tris-HCl，50ml，（瓶塞不漏气）；C2（贮液瓶）：0.10mol/L，pH8.0，Tris-HCl，150ml；洗脱速度：0.2-0.3ml/min；收集体积：2-3ml/管/10-15min。从上样开始收集，洗脱完毕，逐管测定A280。选择A280 较大的管测活，绘制洗脱图。凸形梯度洗脱用在此处的优点：在前几十管分离杂蛋白时，盐梯度增长很快，而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时，盐梯度变化缓慢，有利于该酶与杂蛋白的分离。洗脱后逐管测电导，画出凸形梯度洗脱曲线，并换算出该酶洗脱下来时相应的Tris-HCl缓冲液的盐

16、浓度。（二）、峰管与分离过程中各级分测活：1. 确定合适的稀释倍数，使所得吸光度值在可测范围之内；2. 用微量可见塑料杯，取测酶活底物1.0ml，加入10l已稀释好的酶样品溶液，盖盖摇匀后测A597（15s读一次数），画图计算A597；3. 计算酶的比活力U。（三）、SDS-PAGE检测分离纯度：1. 样品处理：将冰干的待检测样（V7与V8）用0.01MTris-HCl溶解，取20l 溶解的样品，加入20l 样品处理液后沸水浴煮沸5min。样品最终浓度约为1mg/ml ，吸光度A280约为1。2. 灌胶3. 上样：第3孔上V7，第7、第9孔上V8。上样量：20l/孔。4. 加电解槽液在外侧，至

17、高玻璃下。5. 稳压100V电泳，至溴酚蓝到距下沿1cm处。6. 停止电泳。7. 以考马斯亮蓝染色2h，脱色过夜。六、 数据记录及处理：1. 洗脱图及洗脱曲线的测定(表1)：表1 洗脱数据管号A280nm电导率(S/cm)管号A280nm电导率(S/cm)10.006440280.01751020.007290.02053030.049160300.01865040.115310.02074050.094320.02175060.027310330.02374070.010340.02877080.008360350.11599090.011360.2131210100.013390370.2

18、171450110.033580380.1681530120.035390.1341920130.056400.0921710140.251410.061790150.418420.0542750160.553430.0372850170.667440.0332810180.589450.0333100190.297460.0333290200.140470.0363290210.079720480.0363330220.043580490.0453460230.027530500.053335024510.0623310250.021510520.0603530260.022610530.0

19、473730270.018510540.0403890说明： 测量中第24管自动部分收集器发生跳管，即24管中没有接到任何液体； 在开始收集时，由于流速太慢，每管接收不到1ml，所以电导率的测定只有合并几管进行。 由于疏忽，将第13管到第20管在测完吸光度时就合并了，导致了无法逐管测量其电导率。 电导率的数据变化异常。洗脱图 (图1)：图1 洗脱图14-20管为穿过峰，合并得V8；34-40管为活性峰，合并得V7。凸形洗脱曲线图 (图2):图2凸形洗脱曲线图2. 峰管酶活测定 (表2)： 表2 活性峰管酶活测定管号A597nm (每隔15秒读一数)141.5551.3921.2331.0830

20、.9440.8200.7110.618151.3301.0430.7980.6070.4720.3840.3270.290161.2290.8900.6290.4560.3540.2960.2610.238171.1260.6960.4410.3210.2650.2360.2190.208181.2470.9320.6750.4950.3830.3170.2760.250191.3101.1080.9240.7630.6310.5260.4470.387201.5331.4791.4261.3731.3211.2701.2201.17120(稀释2倍)1.4621.4241.3871.3501

21、.3141.2781.2421.20820(稀释5倍)1.4781.4681.4571.4461.4361.4271.4191.140341.3821.3221.2641.2061.1491.0951.0430.993350.9680.8860.8120.7430.6810.6290.5730.528360.3970.3630.3340.3100.2890.2720.2560.243370.8280.7650.7100.6540.6030.5590.5220.486380.9250.8800.8370.7950.7550.7170.6820.648390.8460.8260.8050.7790

22、.7530.7310.7140.697400.8730.8560.8370.8200.8050.7890.7720.753510.6740.6710.6670.6630.6600.6560.6530.650520.7990.7980.7950.7900.7880.7860.7810.776说明： 由于第51、52管的吸光度比周围管稍高一点，所以也被选出测酶活，检测其活性。图3 第14管的A597计算：第14管图4 第15管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图5 第15管的A597 -2计算：第15管图6 第16管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。

23、图7 第16管的A597 -2计算：第16管图8 第17管的A597 -1(线性不好，选前3点重新拟合检查其线性)。图9 第17管的A597 -2计算：第17管图10 第18管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。 图11 第18管的A597 -2计算：第18管图12 第19管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图13 第19管的A597 -2计算：第19管图14 第20管的A597 计算：第20管图15 第34管的A597计算：第34管图16 第35管的A597计算：第35管图17 第36管的A597计算：第36管图18 第37管的A597计算：第3

24、7管图19 第38管的A597计算：第38管图20 第39管的A597计算：第39管图21 第40管的A597计算：第40管图22 第51管的A597计算：第51管图23 第52管的A597计算：第52管各峰管活性及浓度计算：计算公式：比活力（U）： （mol(minmg)）加入酶溶液的浓度（C）：表3 活性峰酶溶液的浓度及比活力管号A597nm浓度C比活力U管号A597nm浓度C比活力U140.5350.285244.04350.2510.131249.08150.9640.475263.83360.0880.24247.27161.0310.628213.42370.1950.247102

25、.63171.3700.758234.96380.1580.191107.54181.0030.669194.90390.0850.15272.70190.7290.338280.38400.0680.10584.19200.2070.159169.25510.0140.07026.00340.2220.032903.04520.0130.06824.853. 各级分吸光度及酶活测定：表4 V1-V7的稀释级分稀释倍数A280nmA597nm（每隔15秒读一次数）V1401.7701.7931.7251.6561.5871.5191.4521.3871.324V2200.2601.9341.8

26、751.8201.7621.7051.6521.6021.552V3101.2871.4771.0000.6670.4680.3600.3000.2630.240V4101.3541.5481.1840.8810.6550.5080.4190.3580.315V5100.2631.7421.6411.5391.4371.3341.2341.1421.057V650.2221.7551.6351.5151.3971.2851.1781.0770.983V7不稀释0.1350.9690.8400.7300.6430.5540.4890.4360.394V8不稀释0.4401.3731.1110.8

27、890.7150.5850.4910.4210.371沉淀2溶解1.6741.4741.2371.1040.9600.8390.7490.673沉淀4溶解0.8970.5390.3450.2670.2320.2140.2040.198说明： 沉淀2是指分离过程中，离心后留取上清液为V2时对应的沉淀。沉淀4是指离心后留取上清液为V4时对应的沉淀。将沉淀用适量去离子水溶解后检验是否有酶活。 第34至第40管合并得到V7，V7体积为12.5ml。 第14至第20管合并得到V8，V8体积为8.4ml。 表中稀释倍数既是指测吸光度A280nm时的稀释倍数，也是酶活测定时的稀释倍数。图24 V1的A597

28、计算：图25 V2的A597计算：图26 V3的A597-1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图27 V3的A597-2计算：图28 V4的A597-1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图29 V4的A597-2计算：图30 V5的A597计算：图31 V6的A597计算：图32 V7的A597计算：图33 V8的A597-1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图34 V8的A597-2计算：图35 沉淀2 酶的A597-1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。图36 沉淀2 酶的A597-2计算：图37 沉淀4 酶的A597-1(线性不好，选前3点重新拟合检查其线性

29、)。图38 沉淀4 酶的A597-2计算：各级酶活及浓度： 计算公式：比活力（U）： （mol(minmg)）加入酶溶液的浓度（C）：表5 V1-V5的比活力级分A597nm浓度C比活力U级分A597nm浓度C比活力UV10.26880.4517.32V60.4411.26227.50V20.2135.9193.7V70.3290.15279.54V31.34514.63119.51V80.8770.50228.02V41.19115.39100.60沉淀20.76V50.3912.99170.00沉淀41.104说明： 沉淀2与沉淀4是通过用去离子水稀释得到，无法得到其稀释倍数。所以无法得到

30、其浓度C与比活力U。从酶活测定曲线来看，所得数据线性不太好，在一定程度上能够说明沉淀中还有一定酶活，但这个酶活已经不高。进一步的定量说明方法还需要与老师再讨论。4. 纯化情况记录：表6 V1-V8的纯化实验步骤（样品）体积（ml）蛋白质浓度（mg/ml）总蛋白（mg）比活力（mol/mgmin）总活力（mol/min）纯化倍数回收率(%)V181.080.456516.4517.32112864.911.00100V2155.55.91919.0193.7086111.245.4176.30V313.214.63193.12119.5123079.776.9020.45V414.515.392

31、23.16100.6022449.905.8119.89V54.62.9913.75170.002337.509.822.07V64.51.265.67227.501289.9313.141.14V712.50.151.88279.54525.5416.140.47V88.40.504.2228.02957.6813.170.85说明： 这里纯化倍数为各级分比活力与V1样品比活力的比值；回收率为各级分总活力与V1样品总活力的比值。5. 电泳检测结果： 图39 电泳检测结果其中第3条道为V7样品，第7与第9条道为V8样品。上样量：20l/孔。可以看到，V7蛋白峰相对比较纯，而穿过峰V8相对含有较

32、多的杂蛋白。七、 讨论与分析:1. 电导率测定中的问题：在我们这次实验测定电导率的过程中，数据出现了非常奇怪的跳跃，不能反应我们进行的浓度凸形梯度洗脱。而且由于一开始流速过慢，每管的接收体积不足1ml，使得开始几管的电导率的测量是通过合并而测得的，但这一点在这里的影响应该不大。因为部分收集器的收集是从一上样就开始的，所以我们通过前几管得到的电导率还不能反映洗脱梯度的变化。而且由于合并，穿过峰处的电导率没有能够逐管测量，失去了关于穿过峰洗脱和电导率本身的重要信息。在电导变化过程中的突跃难以找到合适的解释。这些问题不仅在我们一组的实验结果中出现，有些组也遇到了与我们相同的情况，还有的同学虽然得到了

33、逐步上升的电导率测量结果，但明显不呈凸面梯度变化。这些问题在一定程度上和仪器本身有关，但这样突出的变化的产生可能还应该有其他的、与收集液本身有关的原因，比如，在这次实验中，我们所用的层析方法是离子交换层析，是通过使蛋白带电、实现与层析柱的结合、与蛋白的交换与分离的。这样，收集液中的带电蛋白的有关情况就会对电导率的测量产生影响。但这种影响是难于定性或定量描述的，这些问题还需要与老师和同学进一步讨论。图40 电导率测量由于电导率测量中存在的明显的问题，我觉得以所测的电导率的情况计算酶洗脱下来时相应的Tris-HCl缓冲液的盐浓度，所得到的值的可靠程度需要再考虑。电导率标准曲线：表7 电导率测量电导

34、率（S/cm）6704570缓冲液盐浓度（mol/L）0.010.1图41 电导率与盐浓度以吸光度A280的蛋白峰管为该酶洗脱下来时相应的管第37管，所测电导率为1450S/cm，计算得对应的盐浓度为0.028 mol/L。但这种情况下得到的盐浓度的准确度仍需要比较讨论。2. 洗脱装置:在实验洗脱中，由于我们所得到的塞子有漏气情况，所以我们所用的凸面洗脱装是通过一大一小两个烧杯实现的。我们在实验中所用的是容积分别为250ml和50ml的两个烧杯，在这里应用其的特点是它们截面积的不同，而且截面积比近似于3:1。在大烧杯中装入150 ml，0.10mol/L，pH为8.0的Tris-HCl，在小烧

35、杯中装入50ml，0.01 mol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液。以大烧杯为贮液瓶，以小烧杯为混合瓶，二者以三通管连接好，无气泡。在前面的离子交换层析分离核苷酸的选做实验凸面洗脱分离核苷酸中，我们已经从理论上证明了这种分离体系所实现的是凸面梯度洗脱，能够达到与使用带塞的锥形瓶相同的分离效果。由流经层析柱的洗脱液中的盐浓度公式：C=CB-(CB-CA)*(1-V2/V1) B1/A1C：流经层析柱的洗脱液的盐浓度CB：B瓶的盐浓度，0.1mol/LCA：A瓶的盐浓度，0.01mol/LB1：B的横截面积A1：A的横截面积V2：流经层析柱的洗脱液的体积。V1：洗脱的总体积，150ml

36、约有B1/A1=3:1可以计算得到理论洗脱曲线：图42 电导率与凸形洗脱曲线3. 底物自身变化对酶活测定的影响：在酶活测定中，底物的新鲜与否对实际的测定产生着比较重要的影响。从我们的实验结果中可以看到，使用新配底物所得到数据的线性关系要明显好于使用一些配制时间较长的底物。根据我们实验的情况来看，底物的配制与使用间的时间不要超过半个小时（30分钟），这样能够保证我们所得到的数据的变化真正反映的是酶的催化作用，既保证了数据的有效性，也保证了数据的准确性。在底物溶液的配制过程中，pH需要小心调，pH的反复调节也会对测量结果产生影响。由于底物本身水解的影响，我们应该在实验时将底物溶液以测活方法测量其吸

37、光度A597nm（每隔15秒记一次读数），得到空白对照。然后将以后的酶活测量数据用这个空白对照进行矫正，但这种矫正不是简单的加减就能实现的，这里的矫正方法还需要实验和探索。4. 从分离纯化表中可以看到，经过分离提纯所得到的肌酸激酶仍然保持了较好的活性。在各级分样品的比活力中，蛋白峰V7具有最高的比活力。肌酸激酶是在实验条件下容易失活的一类酶，我们在实验过程中对此比较注意，用冰浴及冰盐浴保证了必要的实验条件。但从实验结果中也可以看到，我们所得到的蛋白的回收率是比较低的，只有0.47%（穿过峰V8回收率为0.85%）。因此，从一定程度上说，我们的分离提纯方法是以牺牲回收率来保证酶活和分离纯度的，所

38、以，我们的分离提纯方法还需要进一步改进，我们也有这种改进的空间，但这需要更多的实验和探索。5. 我们在分离提纯后，用SDS-PAGE检测了级分样品V7和V8的分离纯度。从检测结果来看，严格地说，这两个级分都不够纯。其中V8的杂蛋白更明显一些，而V7基本达到了一条带的纯度要求。这里出现杂带的原因除了分离本身在分离方法、实验操作等方面的一些问题外，也存在着合并后又混进了杂蛋白的问题。因为在实验逐管测定吸光度A280后，我们将吸光度较高的几管都分别合并，得到穿过峰V8与蛋白峰V7。我们合并的管数是比较多，每个级分都在7管左右，这种范围较宽的合并就难免又将已经分离的杂蛋白重新引进来。为了便于说明问题和

39、比较，建议在以后的类似实验中，将蛋白峰峰管或峰管附近的几管分别单独上样，走SDS-PAGE，以检验分离的纯度。6. 在柠檬酸铵溶液的透析过程中，样品的体积发生了微小的变化：由透析前4.6ml变为4.5ml，略有减少。由于量筒的误差，这里的减少应该是可以近似于忽略不计的。与我们不同的是，大部分组的样品体积在透析前后是有较明显变化的，而且是增加的。以柠檬酸铵溶液透析的目的是将乙醇透析出，以避免有机溶剂长时间的存在使得肌酸激酶变性。透析中乙醇与水分子置换，分子大小相差不大，透析液的体积变化应该不大。但如果是用浓硫铵盐透析，盐分子与水分子置换，透析液体积会膨胀很多，所以透析袋在装样品溶液时应该多留一些

40、空间以防止透析袋被破坏。7. A597nm的计算：在比活力计算中我们所需的A597nm是指在酶催化反应过程中，每分钟吸光度值A597nm的变化。在计算中，我们记录了反应过程每隔15秒吸光度A597nm的值，然后作图，选择线性关系较好的、连续的点，而且考虑到底物本身的变化，最好采用时间靠前的数据点。选定点后，以所选点中的初始点吸光度A597nm值减去所选点中的最终点的A597nm值，然后除以这两个点的时间间隔（以分钟为单位），这样就得到了酶催化反应过程中每分钟吸光度值的变化。这里为了保证数据的有效，所选点最少不能少于3个。在这里，我没有使用线性拟合，然后以拟合斜率乘以时间变化来计算A597nm。这两种方法是有一些差别的，在这里使用上述计算方法而没有用线性拟合