细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)

1、123 准备及注意事项准备及注意事项 换换 液液 传传 代代 冻冻 存存 复复 苏苏 MTTMTT41.1.紫外灯照射细胞室紫外灯照射细胞室3030分钟分钟, ,风机运行风机运行1010分钟后方分钟后方可进入实验室可进入实验室. .2.2.穿专用的口罩穿专用的口罩, ,帽子帽子, ,拖鞋拖鞋, ,工作衣等工作衣等. .3.3.带手套带手套, ,并用酒精擦拭之并用酒精擦拭之. .4.4.准备好实验必需用品准备好实验必需用品. .5.5.超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. .6.6.超净工作台内操作完成后，超净工作台内操作完成后，要用酒精棉球擦拭台面要用酒精

2、棉球擦拭台面, ,除了酒精灯除了酒精灯, ,镊子镊子, ,试管架等物品试管架等物品外外, ,其他都要拿出工作台外其他都要拿出工作台外. .紫外灯照射紫外灯照射3030分钟分钟. .51.1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出把细胞培养瓶从培养箱中拿出, , 拧紧盖子拧紧盖子; ;2.2.观察瓶内培养基的颜色观察瓶内培养基的颜色, , 是否浑浊等是否浑浊等; ; 放在倒放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。置显微镜下观察细胞生长状况。3.3.放入超净工作台内放入超净工作台内, ,点燃酒精灯点燃酒精灯, ,拿培养瓶口在酒拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上精灯火焰上转两圈以上, ,至少三秒至少三秒. .4.4.

3、取下盖子取下盖子, ,烧瓶口烧瓶口; ;倒掉培养基倒掉培养基, ,烧瓶口烧瓶口; ;5.5.拿出拿出PBSPBS液瓶子液瓶子, ,烧瓶口和镊子烧瓶口和镊子; ;用镊子将塞子取用镊子将塞子取出出, ,烧瓶口（至少烧瓶口（至少1010圈）。圈）。66.6.用吸管吸取用吸管吸取3ml3ml的的PBSPBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，打入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此操作一次。重复此操作一次。7.7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少烧瓶口（至少1010圈）

4、。圈）。8.8.用吸管吸取用吸管吸取5ml-8ml5ml-8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口，的培养基打入培养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子；镊子和盖子；9.9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期，盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意：注意：1.1.打开培养箱时尽量不要说话；打开培养箱时尽量不要说话；2.2.步骤步骤9 9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。 71.1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；

5、2.2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。倒置显微镜下观察细胞生长状况。3.3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。4.4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；5.5.拿出拿出PBSPBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少子取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。8 6. 6.用吸管吸取用吸管吸取3ml3ml的的PBSP

6、BS，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此。重复此 操作一次。操作一次。7.7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。8.8.用吸管吸取用吸管吸取1ml1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；9.9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；用酒精棉球擦

7、瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 5分分钟钟 后取出；后取出；910.10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。细胞变成单个圆形，则可进行传代。11.11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。12.12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。13.13.用吸管吸取用吸管吸取5ml5ml的培养基打入培养瓶内，的培养基打入培养瓶内， 用吸

8、管吹打成单个细胞悬液。计数，分装用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。即可。101.1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；2.2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。微镜下观察细胞生长状况。3.3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。4.4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；5.5.拿出拿出PBSPBS瓶子，烧瓶口和

9、镊子；用镊子将塞子取出，瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少烧瓶口（至少1010圈）。圈）。116. 6. 用吸管吸取用吸管吸取3ml3ml的的PBSPBS，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此。重复此操作一次。操作一次。7. 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。8. 8. 用吸管吸取用吸管吸取1ml1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子；养

10、瓶口和盖子，盖上盖子；9. 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 5分钟后取出；分钟后取出；10. 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。变成单个圆形，则可进行传代。1211.11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。12.12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；

11、用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。13.13.用吸管吸取用吸管吸取5ml5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。吹打成单个细胞悬液。14.14.用吸管将细胞悬液移至用吸管将细胞悬液移至5ml5ml离心管中，盖上盖离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，子，在离心机内离心，15001500转转/ /分钟，时间为分钟，时间为1515 分钟。分钟。15.15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。塞子，烧管口。1316.16.弃上清液，加冻存液弃上清液，加

12、冻存液2ml 2ml 吹打，使细胞均匀混吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加在冻存液中，再加3ml3ml冻存液，用吸管吸出打入冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管多个冻存管中，每管1.5ml1.5ml。17.17.盖上盖子，用封口膜封好盖上盖子，用封口膜封好, ,标上细胞名称和日标上细胞名称和日期期 . .18.18.冻存方式：冻存方式：430430分钟，分钟，-2015-2015分钟，分钟，- -80608060分钟，最后转移到液氮罐内。分钟，最后转移到液氮罐内。注意：注意：冻存管移动时要夹在冰块中间。冻存管移动时要夹在冰块中间。141.1. 取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，取

13、一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，温度设置为温度设置为39.039.0。2.2. 等达到等达到39.03039.030分钟后，用镊子将欲复苏的细胞分钟后，用镊子将欲复苏的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶内，晃动，使冻从液氮管中取出，快速放入敞口瓶内，晃动，使冻存管内完全液化。存管内完全液化。3.3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。4.4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口；用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口；5.5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已装有用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已装有5ml5ml新鲜培养基的培养瓶内。新鲜培养基的培养瓶内。156.

14、 6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子，烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。在倒置显微镜下观察。7. 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. .注意：注意： 步骤步骤2 2中，蒸馏水不要没过冻存管口中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过所有步骤结束过2424小时后一定要换液；小时后一定要换液；161.1.实验开始前，实验开始前，9696孔板应在超净台紫外灯下照射孔板应在超净台紫外灯下照射2 2个个小时以上。小时以上。2.2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBSPBS，加胰酶消，加胰酶消化，加培养基，计数。

15、化，加培养基，计数。 （方法及步骤同传代（方法及步骤同传代1-131-13步。）步。）3.3.加培养基，调整细胞浓度为加培养基，调整细胞浓度为1000010000个个/200l./200l.4.4.加到加到9696孔板内孔板内, ,每板每板6 6行行8 8列共列共4848孔孔, ,每孔每孔200l.200l.5.5.盖上盖上9696孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，标明名称，序号和日期。察，标明名称，序号和日期。176. 6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养2424小时。小时。7. 7. 从培养箱中取出，镜下观

16、察，拿到工作台内，从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 用用200l200l的枪将孔内的培养基吸出；的枪将孔内的培养基吸出；8. 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基加入不同浓度的药物的无血清培养基, ,每孔每孔200l200l。9. 9. 盖上盖上9696孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养2424 小时。小时。10.10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加每孔加MTTMTT液液20l20l。1811.11.盖上盖上

17、9696孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养4 4 小时。小时。12.12.取出取出9696孔板，倒掉孔内的液体，每孔加孔板，倒掉孔内的液体，每孔加 DMSO150lDMSO150l，放入酶标仪内，振荡，放入酶标仪内，振荡600600秒，秒， 读数即可。读数即可。注意：注意： 本实验以本实验以CHLCHL细胞为例细胞为例. .加加DMSODMSO时，带口罩和手套。时，带口罩和手套。放入酶标仪内时，放入酶标仪内时，9696孔板勿盖盖子。孔板勿盖盖子。多重复几次。多重复几次。19P

18、BSPBSRPMI1640RPMI1640培养基培养基消化液消化液冻存液冻存液清洁液清洁液MTTMTT其它溶液其它溶液20之后，加之后，加1000ml1000ml三蒸水三蒸水, ,调节调节PHPH值在值在7.2-7.47.2-7.4之间之间, ,高压高压121 121 ,30 ,30分钟分钟,4,4备用。备用。211.1.取一小袋取一小袋16401640培养粉，加高压过的三蒸水培养粉，加高压过的三蒸水800ml800ml，在，在1000ml1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；2.2.加碳酸氢钠加碳酸氢钠2.0g2.0g，再加三蒸水定容至，再加三蒸水定容至1000ml

19、1000ml；3.3.加青霉素加青霉素(100U/ml) ，链霉素，链霉素（100 g/mlg/ml）；4.4.在超净工作台内过滤除菌，分装成在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml180ml，- -2020备用。备用。注意注意 烧杯要泡过酸，并在紫外线下照射至少烧杯要泡过酸，并在紫外线下照射至少3030分钟。分钟。221.1.称取胰蛋白酶粉称取胰蛋白酶粉0.50.5克，溶入克，溶入PBSPBS缓冲液缓冲液200ml200ml，2.2.混匀，调整混匀，调整PHPH值到值到7.27.2，3.3.过滤除菌，用过滤除菌，用1.5ml1.5ml的的EPEP管分装，管分装，-20-20冻存。冻存。4.4

20、.取少许放入已培养的无污染的培养基中取少许放入已培养的无污染的培养基中 培养。培养。23高压过的二甲基亚砜高压过的二甲基亚砜DMSODMSO，胎牛血清和无血清培，胎牛血清和无血清培养基按养基按1:3:61:3:6的比例配制。的比例配制。例如配制例如配制10ml10ml的冻存液：的冻存液： 高压的小瓶中加高压的小瓶中加3ml3ml过滤的胎牛血清，过滤的胎牛血清， 再加再加6ml6ml培养基，最后加培养基，最后加1ml1ml的的 DMSO, DMSO,混匀即可。混匀即可。2425一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色，一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色， 多次使用后，成绿色时就不能再用多次使用

21、后，成绿色时就不能再用, , 需重新配制。需重新配制。注意：注意：保护自己；保护自己；先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量太多，使容器破裂。太多，使容器破裂。 26方法方法1.1. 称取称取25mgMTT, 25mgMTT, 加入加入5ml PBS5ml PBS液液, , 混匀混匀, , 即成即成5mg/ml5mg/ml的的MTTMTT液；液；2.2. 用用0.22m0.22m的微孔滤器除菌的微孔滤器除菌, , 避光避光, 4, 4保存一周内使用保存一周内使用.

22、.原理原理 活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使MTTMTT（黄绿色）分解，（黄绿色）分解，产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围；产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围；其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。注意注意 MTT MTT法只能测定细胞相对数和相对活力法只能测定细胞相对数和相对活力, , 不能测定细胞不能测定细胞绝对数绝对数. .2795%95%到到75%75%的酒精的配制比例为的酒精的配制比例为4:14:1， 例如例如, ,配制配制100ml75%100ml75%的酒精的酒精,80ml 95%,80

23、ml 95%酒精加酒精加20ml20ml三蒸水即可。三蒸水即可。36%-38%36%-38%的浓的浓HCLHCL到到5%5%的稀的稀HCLHCL的配制比例为的配制比例为3:173:17， 例如例如, ,配制配制1000ml1000ml的的5%5%的稀盐酸的稀盐酸,150ml,150ml的浓的浓HCLHCL加加850ml850ml的蒸馏的蒸馏水即可。水即可。28方法方法吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。计数板之间。静置三分钟静置三分钟镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml=/ml=四大格细胞总数四大格细胞总数/4 /4 10104 4个个注意注意镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算; ;若细胞团数量占若细胞团数量占10%10%以上，重新制备细胞悬液。以上，重新制备细胞悬液。计数时，计左侧和上方的压线细胞，右侧和下方的压