PCR原理及检测方法解读

1、PCR原理及检测方法 一、一、PCR的定义：的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增扩增技术。技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。片段的技术。 PCR技术：技术：19851985年由美国年由美国 Cetus 公司的公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百片段扩增一百万倍以上。万倍以上。 优点：优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便好以及快速简便等，广泛

2、应用于微生物学、考古学、等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。对目的基因进行分析、鉴定。 Kary Mullis 本人因此获本人因此获19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 二、二、PCR的原理：的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，片段，类似于天然类似于天然DNA的复制过程。的复制过程。 以拟扩增的以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模分

3、子为模板，以一对分别与模板板5 5末端和末端和3 3末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，在在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过合成，重复这一过程，即可使目的程，即可使目的DNA片段得到扩增。片段得到扩增。 扩增的特异性取决于引物与模板扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异的特异结合结合，基本反应步骤分三步：，基本反应步骤分三步：1. 变性变性 (Denaturation)： 加热使模板加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两双链间的氢键断裂而形成两条单

4、链。条单链。94 302. 退火退火 (复性复性) (Annealling): 突然降温后模板突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。发生在模板与引物之间。55 30 3. 延伸延伸 (Extension): 将反应温度调节到将反应温度调节到酶的最适温度酶的最适温度，在，在DNA聚合聚合酶、酶、4种种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物及镁离子等存在的条件下，以引物的的 3 端开

5、始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新新DNA链。链。72 1 上述上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本步为一个循环，每经过一个循环，样本中的中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过一轮循环的模板，经过2540个循环后个循环后DNA可扩增可扩增106 109 倍。倍。 变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 目目 录录PCRPCR技术

6、原理技术原理 PCR扩增的特异性扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所是由一对寡核苷酸引物所决定的决定的。反应初期，原来的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物最终的扩增产物是介于两种引物是介于两种引物5 端之间的端之间的DNA片段片段。 三、三、PCR的成分和作用：的成分和作用： 1. 缓冲液：缓冲液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持维持 Taq 酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性 25 50 mM K

7、Cl 促进引物退火，促进引物退火，50 mM 会抑制会抑制 Taq 酶的活性。酶的活性。 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。也有类似作用。 2. MgCl2: 1.5 2.0 mM Taq 酶具有酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活

8、性显著下特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。降。 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物底物 0.02 0.2 mM dNTPs 可与可与 Mg2+ 结合，应注意结合，应注意Mg2+ 浓度浓度与与dNTPs 浓度之间的关系，浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比浓度比 dNTPs 浓度高浓度高 0.2 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 4. 引物引物 (Primer-P)： 预扩增核酸

9、片段两端的已知序列，决定特异性。预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 1 M 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。偏低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：聚合酶：耐高热耐高热 0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l 偏高：引物非特异产物的扩增偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低偏低：产物量降低6. 模板模板DNA (Template): 最低最低102 105 bp DNA片段，实际用量远远片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中

10、摸索。超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 l 过高：非特异产物增加过高：非特异产物增加 过低：产量降低过低：产量降低7. 水：水： 去离子水，补足整个反应体积。去离子水，补足整个反应体积。 四、四、PCR反应体系：反应体系： 各种成分的实际用量应根据实各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。的储备液浓度进行核算。 五、五、PCR反应条件优化：反应条件优化： 1、温度、循环参数：、温度、循环参数： 变性温度和时间：变性温度和时间： 保证模板保证模板DNA解链完全是保证整个解链完全是保证整个PCR扩增成扩增成功的关键功的关键

11、。 加热加热9095，30 60 s，再复杂的，再复杂的DNA分分子也可变性为单链。根据模板子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30 ，可使各种复杂的可使各种复杂的DNA分子完全变性。分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活酶活性和性和dNTP分子造成损害。分子造成损害。 复性温度和时间：复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和复性温度的选

12、择，可根据引物的长度和G+C含含量确定，长度在量确定，长度在15 25 bp 之间时，复性温度之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于计算得到，一般位于40 60，30 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。低，产物特异性越低。 一般情况下选择一般情况下选择55 30，足以使引物与模板，足以使引物与模板之间完全结合。之间完全结合。 延伸温度和时间：延伸温度和时间： 一般位于一般位于Taq酶最适作用温度酶最适作用温度70 75 之间。之间。 引物小于引物小于16个核苷酸时，过高的延伸

13、温度不利于引个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到物与模板的结合，可以缓慢升温到70 75 。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， 1Kb需加长延伸时间，需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达片段延伸时间可达15分钟。分钟。 延伸时间过长可出现非特异扩增，常用延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 1。 循环数：循环数： 其他参数选定后，其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于循环次数主要取决于模板模板DNA的浓度。的浓度。 理论上说理论上说20 25次循环后，次循环后，PCR产物的积累产物的积累即可达到最大值，实

14、际操作中由于每步反应的产即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，因此不管模板浓度是多少，20 30次次是比较合理的循环次数。是比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。循环次数越多，非特异扩增增加。六、六、PCR扩增产物的分析扩增产物的分析常用琼脂糖凝胶电泳常用琼脂糖凝胶电泳上排：上排：1：marker 2：阴性对照：阴性对照 3-17： 标本（引物为标本（引物为CA16）下排：下排：1-3： 标本（引物为标本（引物为CA16）4：CA16引物的阳性对照引物的阳性对照5：marker6：阴性对照：阴性对照 7-14：标本（引

15、物为：标本（引物为EV71）15：EV71引物的阳性对照引物的阳性对照RT-PCR技术 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。Real-Time PCR技术 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等

16、比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。 当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，因而荧光基团发射出荧光信号。 随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 一般而

17、言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以

18、设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。PCR检测对标本采集及保存、运输的要求 咽拭子、粪便、疱疹液、脑脊液等。 用于病毒分离和核酸检测的标本尽早采集。 病毒储存液保存。 冷链运输，尽快送至实验室进行检测。 -20长期保存，但是流感样病例标本应于-70长期保存新型甲型H1N1流感检测核酸提取使用试剂：核酸提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini kit（74104）； 预冷的70%乙醇溶液（无RNas

19、e水配制）（自备）；-巯基乙醇（自备）基本步骤：裂解组织，释放核酸；除去蛋白杂质；最后获得核酸产物注意事项：1提取核酸过程中使用的所有溶液和耗材必须经过特殊处理，确保无RNase 2操作过程中必须尽量保持低温，迅速3操作要在生物安全柜中进行，检测标本样品和试剂必须在生物安全柜中才可以打开操作中必须做好防护，防止降解，污染和感染；4提取好的核酸若不立即进行检测，应于-20保存RT-PCR检测1）反应体系配制）反应体系配制（25ul体系）（在专门的生物安全柜中进行）：使用试剂盒使用试剂盒：QIAGEN one step RT-PCR kit（210212） RNase free water 11.

20、9ul 5RT-PCR缓冲液缓冲液 5ul10mM dNTP 1ul Enzymix 1ul RNasin 0.1ul 上游引物上游引物 (20uM) 0.5ul 下游引物下游引物 (20uM) 0.5ul合计合计 20ul对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20L，分别做好标记。 3）加RNA模板

21、（在核酸提取区）将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5L无菌水），然后分别加标本RNA（每管5L），最后加入阳性对照RNA（每管5L）。反应条件：反应条件：1、 60 1分钟2 、42 10分钟3、 50 30分钟4 、95 15分钟5 、94 30秒6、 50 30秒7 、72 1分钟回到第5步 40个循环8、 72 10分钟9、end电泳并观察结果电泳并观察结果： 提前用1的TBE缓冲液配制1.5-2%Agrorose gel ，胶块凝固后将其放置在加有1TBE缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液必须淹没胶块。电泳液最好新鲜配制。PCR结束后，各取5ul PCR产物和1ul

22、6Lodding Buffer混匀，点样，同时加DL2000 Marker 5ul ，阴、阳性对照； 电泳电压：120V时间：胶块的体积和浓度都对电泳时间有影响，一般30min-1h。根据Lodding Buffer中的溴芬兰指示剂的位置来判断电泳的程度，一般蓝色指示条带泳动到胶块2/3 位置处，就可以观察结果了NICNIC引物引物引物名称引物名称目的片段目的片段大小大小备注备注FluAFluA-M-F30235bp甲型流感病毒M基因通用检测引物FluA-M-R264H1HAH1 F1147527bpH1N1亚型检测通用引物H1 R1673HuH1HAH1HA F768327bp人 季 节 性

23、 流 感 病 毒H1N1亚型检测引物H1HA R1094SWH1HA-1SW-H1 F786153bp此次甲型H1N1亚型流感病毒引物SW-H1 R920RnasePRnaseP F约80bp与 real-time PCR 中RnaseP引物一致RnaseP RPCR引物待检样品1待检样品2待检样品3待检样品4待检样品5待检样品6FluA_+/-H1HA_+/-HuH1HA_+_+/-SWH1HA-1_+_+/-RnaseP+_结果判断非 甲 型 流非 甲 型 流感病毒感病毒甲 型 流 感甲 型 流 感病毒病毒人 季 节 性人 季 节 性H1N1H1N1 亚 型亚 型流感病毒流感病毒猪猪 H1

24、N1H1N1 亚亚型 流 感 病型 流 感 病毒毒送 国 家 流送 国 家 流感 中 心 检感 中 心 检测测标 本 不 是标 本 不 是人 源 标 本人 源 标 本/ / 标 本 中标 本 中细 胞 量 少细 胞 量 少/ / 实 验 或实 验 或仪器问题仪器问题非非 H1N1H1N1 亚亚型型送 国 家 流送 国 家 流感 中 心 复感 中 心 复核核Real-time PCR检测体系的配制（25ul体系）：RNase free water 5.75ul 2Master Mix 12.5ul RT-Mix 0.25ul Primer-1（40uM) 0.5ul Primer-2 (40uM

25、) 0.5ul Probe (10uM) 0.5ul 上述成分混匀，每管加入5ul待检样品的核酸，封盖，上机。样品多时，同RT-PCR体系的配制方法，混匀分装。必须同时设定阴、阳性对照和空白对照引物名称引物名称备注InfAForward甲型流感检测通用引物InfAReverseInfAProbeSWInfAForward此次甲型流感通用引物SWInfAReverseSWInfAProbeSWH1Forward此次甲型H1N1亚型流感检测特异性引物SWH1ReverseSWH1ProbeRnaseP-Forward人上皮细胞RNP基因特异性引物RnaseP-ReverseRnaseP-Probe

26、反应条件：反应条件：1、60 5min2、50 30min3、95 15min4、95 15s5、55 30s6、72 30s7、 read plate8 、goto step4，for 45 cycles9、72 5min10、read plate11、end注意事项RT-PCR引物稀释方法-工作浓度（20M）配制方法：110储存液配制：（1）将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100pmol/L，即100M。2引物使用浓度配制：将100M的引物浓度再5倍稀释，配成浓度为20M

27、，即可直接用于PCR反应。（请注意各引物管实际所标记的OD数）Real-time PCR检测引物和探针稀释方法1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若1OD的量为4.75 nmol （0.00475mol），则一管引物的总摩尔数为24.75=9.5nmol，加水量为109.595l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。2探针工作浓度（10M）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10倍稀释，此时浓度为10M，可作为工作浓度。引物、探针稀释后，-20保存阳性对照RNA收到后分装成若干管，置-20或以下保存在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。使用的试剂必须从冷冻状态彻底融化混匀后使用（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）