PCR和简并引物设计

1、PCR技术及其在基因同源克隆技术及其在基因同源克隆中的应用中的应用缪恒彬缪恒彬2007.05.15PCR技术的基本原理技术的基本原理1985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室公司人类遗传研究室的的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应酶链反应( Polymorphism Chain Reaction )。其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制，只是在试的体内复制，只是在试管中给管中给DNA的体外合成提供一种合适的条的体外合成提供一种合适的条件件-模板模板DNA ，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合聚合酶，合适的缓冲体系，酶，合适的缓冲体

2、系，DNA变性、复性及变性、复性及延伸的温度与时间。延伸的温度与时间。 P cr.e x ePCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件25ul 标准反应体系标准反应体系:10扩增缓冲液扩增缓冲液 2.5ulMg2+ (25mmol/L) 1.5ul dNTP (10mmol/L) 2.0ul 模板模板DNA (20ng/ul) 2.0ul正向引物正向引物(10umol/L) 1.0ul反向引物反向引物(10umol/L) 1.0ul Taq DNA聚合酶聚合酶 (5U/ul) 0.2ul加双蒸水至加双蒸水至 25ul 引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的特异产物

3、的特异性取决于引物与模板性取决于引物与模板DNA互补的程度。互补的程度。 PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件引物长度：引物长度： 15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增效太少扩增效果不佳，果不佳，G+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分最好随机分布，避免布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产

4、生非特异的端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。扩增条带。引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。失败。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。明显同源性。 设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的一般的PCR反应中，各种反应中

5、，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0mmol/L为宜。为宜。Mg2+浓度浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物聚合酶的活性，使反应产物减少。减少。模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否成败与否的关键环节之一，一般的的关键环节之一，一般的PCR反应核酸模反应核酸模板量在板量在10100ng都能得到有效扩增。都能得到有效扩增。PCR反应条件的选择反应条件的选择 PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件变性温度与时间

6、：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。失败的最主要原因。一般情况下，一般情况下，9394 lmin足以使模板足以使模板DNA变性，若低于变性，若低于93则需延长时则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。基序列的长度。 Tm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度复性温度=Tm值值-(510) 在在Tm值允许

7、范围内，值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与，足以使引物与模板之间完全结合。模板之间完全结合。延伸温度与时间：延伸温度与时间：一般选择在一般选择在7075之间，常用温度为之间，常用温度为72，过高的延，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般长度而定，一般1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间

8、片段，延伸时间1min是足够的。延伸进间过是足够的。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数：循环次数决定循环次数决定PCR扩增程度。扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。产物的量亦随之增多。 基因克隆方法基因克隆方法基因芯片技术基因芯片技术基因文库技术基因文库技术功能蛋白组技术功能蛋白组技术PCR技术技

9、术mRNA差异显示技术差异显示技术插入突变插入突变图位克隆图位克隆酵母双杂交系统酵母双杂交系统生物信息学技术生物信息学技术同源基因克隆中的同源基因克隆中的PCR技术技术RT-PCRcDNA合成合成简并引物设计简并引物设计RACE-PCR3RACE5RACE同源基因克隆中的同源基因克隆中的PCR技术技术cDNA合成合成简并引物设计简并引物设计选择同源基因选择同源基因氨基酸序列氨基酸序列递交递交GENEBANK进行进行BlastP/BLAST//blocks/make_blocks.htmlhttp:/

10、/blocks/codehop.html选择相关的选择相关的氨基酸序列氨基酸序列 递交服务器递交服务器进行进行Block Maker同源区段结果同源区段结果递交递交Codehop服务器服务器选择合适选择合适简并引物简并引物常用引物设计软件：常用引物设计软件：Primer Premier 5.0引物设计服务器：引物设计服务器：/引物分析评价软件：引物分析评价软件：Oligo 6.0不同物种同源基因氨基酸序列选择不同物种同源基因氨基酸序列选择简并引物设计简并引物设计选择同

11、源基因选择同源基因氨基酸序列氨基酸序列递交递交GENEBANK进行进行BlastP/BLAST//blocks/make_blocks.html/blocks/codehop.html选择相关的选择相关的氨基酸序列氨基酸序列 递交服务器递交服务器进行进行Block Maker同源区段结果同源区段结果递交递交Codehop服务器服务器选择合适选择合适简并引物简并引物常用引物设计软件：常用引物设计软件：Pri

12、mer Premier 5.0引物设计服务器：引物设计服务器：/引物分析评价软件：引物分析评价软件：Oligo 6.0简并引物设计简并引物设计选择同源基因选择同源基因氨基酸序列氨基酸序列递交递交GENEBANK进行进行BlastP/BLAST//blocks/make_blocks.html/blocks/codehop.html选择相关的选择相关的氨基酸序列氨基酸序列 递交服务器递交服务器进行进行Block Maker同源区段结果同源区段结果递交递交Codehop服务器服务器选择合适选择合适简并引物简并引物常用引物设计软件：常用引物设计软件：Primer Premier 5.0引物设计服务器：引物设计服务器：/引物分析评价软件：引物分析评价软件：Oligo 6.0AAAAAAAAAAAAAAAA5UTR3UTRORFAAAAAAAAAAAA