分子生物学第五章---DNA分子基本操作技术

1、第五章第五章 DNADNA分子基本操作技术分子基本操作技术1220132013年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 北京时间10月7日下午5点30分，美国、德国三位科学家詹姆斯-E.罗斯曼、兰迪-W.谢克曼及托马斯-C.苏德霍夫因在细胞内运输系统领域的新发现而获得今年诺贝尔生理学或医学奖。诺奖委员会说，三人发现了细胞囊泡交通的运行与调节机制。3 膜融合的发现表明蛋白质和其他物质可以在细胞内和细胞间进行传递，细胞可以用这一过程来阻止它们的活动并且避免混乱。这一突破性发现解释了为什么胰岛素释入血液时会有变化、神经细胞之间的信息传达，以及病毒感染细胞的方式。4 生物体内细胞的正常运转有赖于让

2、合适的分子在合适的时间抵达合适的位置。一部分分子，如胰岛素，需要被转运出细胞之外，而其他分子则需要被在细胞内部进行运输。细胞内部产生的分子被包裹于囊泡之中（图中蓝色表示），但是这些囊泡具体是如何达成这种精准的运输的？这一点一直没有被理解。5 Randy W. Schekman发现基因控制下的蛋白质在这种囊泡运输机制中起到重要作用。正如这里的图上所展示的那样，通过对比正常酵母菌细胞（左）和转运机制缺陷的细胞（右），他成功识别出操控这一转运过程的基因。6 James E. Rothman发现一种蛋白质化合物（图中橘色表示）可以让囊泡实现与目标细胞膜的融合。囊泡上的蛋白质物质会与目标细胞膜上的特定蛋

3、白质之间发生结合，从而让囊泡可以在正确的位置上释放其所运载的特殊“分子货物”。7 Thomas C. Sdhof研究了大脑中神经细胞之间是如何互相传递信号的，以及钙离子在这一过程中所起的作用。他识别出一种分子机制（图中用紫色表示），其可以对进入的钙离子发生反应并触发囊泡融合，从而解释了囊泡输运机制中时间的精确性是如何达成的，以及其所携带的信号分子物质是如何能做到受控释放。8约翰约翰. .戈登戈登 山中伸弥山中伸弥获奖理由：获奖理由：发现成熟细胞可被重编程变为多能性920122012年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖第五章第五章 DNADNA分子基本操作技术分子基本操作技术10从20世

4、纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。11本章内容本章内容 第一节 核酸凝胶电泳技术 第二节 核酸分子杂交 第三节 PCR 第四节 转化 第五节 基因组文库构建 第六节 RNA操作技术 第七节 基因克隆12 一、常规电泳 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、脉冲凝胶电泳第一节第一节 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术13一、常规电泳一、常规电泳自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核

5、酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种

6、成分彼此分离。14 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔1516171、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝

7、胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等181 1）凝胶浓度选择）凝胶浓度选择琼脂糖浓琼脂糖浓度度(%)线型线型DNA分子的分分子的分离范围离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围19 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越

8、高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 2 2）电泳缓冲液）电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解201010TBETBE缓冲液的配制缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.08.2 临用时

9、用水稀至0.5TBE（20倍稀释）213 3）核酸电泳的指示剂）核酸电泳的指示剂 指示剂：溴酚兰二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色琼脂糖凝琼脂糖凝胶浓度胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb22核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb234 4）载样缓冲液）载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电

10、泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便24 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖 凝 胶 电 泳 中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。255 5）核酸电泳的染色剂）核酸电泳的染色剂在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNADNA分子发出荧光分

11、子发出荧光26琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间27称样溶解加热制板倒胶6 6）核酸电泳操作基本程序）核酸电泳操作基本程序28取样点样电泳检测核酸电泳操作基本程序核酸电泳操作基本程序29结果结果30根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小31Agarose gel electrophoresis322 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离33聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙

12、烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间34聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和过硫酸铵（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的351 1）不同浓度丙烯酰胺和）不同浓度丙烯酰胺和DNADNA有效分离范围有效分离范围 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分离范围有效分离范围（bp）溴酚兰溴酚兰*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0

13、604004516012.040200307015.025150156020.0101001245362 2）材料）材料 电泳仪器： 电泳仪 垂直电泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4可保存二个月372）材料）材料 10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克，加水至 10 ml4可保存一周，-20可保存一个月 1TBE电泳缓冲液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）383 3）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃

14、板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角 按表配制所需%浓度凝胶的毫升数 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止39 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少液体泄漏的机会 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1TBE缓冲液40 小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则

15、 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡41 接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳 电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）4243电泳结果分析电泳结果分析 DNA MarkerDNA Marker DNA DNA 人工片段人工片段 100 bp ladder100 bp ladder44酶切分析酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶

16、切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究4546PCR-RFLP46二、脉冲凝胶电泳二、脉冲凝胶电泳(PFGE)(PFGE) 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。超过一定大小的线状DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（50Kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，在常规电泳凝胶中彼此挤压，形成单一DNA迁移带。1984年Schwartz和Cantor首次利用脉冲凝胶电脉冲凝胶电泳（泳（pulsed-field gel electrophoresi

17、s, PEGE ）解决了这一问题。4748PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理PFGE PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小，小分子小分子DNA比大分子比大分子DNA更容易在凝胶中重新定位更容易在凝胶中重新定位，因而迁移速度更快。该法可分离长至10Mb的DNA分子。B+A-+A-B49A-+AB-+B正交交变电泳凝胶电泳(OFAGE)电场逆转凝胶电泳(FIGE)夹角等值均一电场(CHEF)旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+PEGE类型50影响PFGE分辨率

18、的因素1、脉冲时间（脉冲时间（0.1s-1000s）：）：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2、电压：、电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。3、电场夹角：、电场夹角：电场方向的夹角常为110O - 120O，研究证实90O夹角也非常有效。4、温度：、温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。51第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Ins

19、titute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 52核酸的分子杂交核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。53 不同温度下DNA的构型变化一54 不同温度下DNA的构型变化二55 杂种核酸分子：杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用 检测

20、特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。56一、核酸杂交常用几种膜的性能比较一、核酸杂交常用几种膜的性能比较571 1、硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片段，不能同RNA结合。 改进：应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。 RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。58 尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。

21、592 2、SouthernSouthern（萨瑟恩）（萨瑟恩）DNADNA印迹印迹杂交杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E. Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。 60SouthernSouthern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液61杂交模式

22、图杂交模式图放射自显影DNA印迹转移探针杂交62Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测6364（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝胶转移凝胶转移杂交技术杂交技

23、术656667Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X X光显像图片光显像图片 水稻（水稻（Oryza sativa LOryza sativa L.) .)的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)Bgl(A-C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、和）、和HindHind（J-LJ-L）消化，加样在含有）消化，加样在含有EtBrEtBr染料的染料的1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同3232P P标记的玉米标记的玉米psbApsbA探

24、针作探针作SouthernSouthern杂交。杂交。X X光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbApsbA基因序列。基因序列。68Southern BlottingSouthern Blotting的过程的过程1.1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNADNA2.2.通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳液的移动转移胶中的DNADNA3.3.固定胶中的固定胶中的DNADNA4.4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.5.结果检测结果检测69 在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射

25、自显影技术在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有，即便每带电泳条带仅含有2ng的的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术，虽，虽然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。常用的荧光染料：常用的荧光染料：C5、C3等等703 3、诺赛恩、诺赛恩RNARNA印迹技术（印迹技术（Northern Northern blottingblotti

26、ng）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。71 1、Northern blot基本原理和基本过程与 Southern blot基本相同 2、用于鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样

27、品为总RNA或mRNA72Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA73Step 1. Antibody Recognitionof target protein/antigenStep 2. Secondary Antibodyrecognition of primary AbStep 3. Color Development744 4、斑点

28、印迹杂交和狭线印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种类似的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应于核酸样品的定量检测。75 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量76斑点印迹杂交斑点印迹杂交 将RNA或DNA直接点样

29、于NC膜或尼龙膜上，可做半定量分析 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 DNA斑点杂交 RNA斑点杂交 完整细胞斑点杂交7778（1 1）DNADNA斑点杂交：斑点杂交： 先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。 将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点 5l(210g DNA)。 将膜烘干，密封保存备用。 （2 2）

30、RNARNA斑点杂交：斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10g总RNA（经酚/ 氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5l DEPC水，加5l 甲醛/SSC缓冲液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然 后取5-8l点样于处理好的滤膜上，烘干。（3 3）完整细胞斑点杂交：）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标

31、本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 794 4、菌落杂交、菌落杂交也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。 鉴定重组子。80检测重组体克隆的菌落杂交技术81821）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA

32、杂交83 保持组织细胞的形态 对核酸无抽提、修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定 2）杂交过程：（1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：84（2）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落85（3）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号

33、检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察86（4）杂交 杂交液体积小：1020l cDNA和RNA探针杂交温度约为50 杂交时间:DNA探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 515分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50 87（5）杂交结果检测 所用探针为核素标记,放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测8889直接法荧光原位杂交原理89荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）90 5 5、蛋白质、蛋白质/DNA/DNA、蛋白质、蛋白质/RNA/RNA杂交技术杂交技术91又叫D

34、NA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），也称作Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理： DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。92凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的DNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自

35、显影中呈现滞后的条带慢，在放射自显影中呈现滞后的条带ACB放射自显影凝胶电泳放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合93 不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片段结合的蛋白质分子 而且可以研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）94(a)(b) (c) 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用（a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带

36、消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。蛋白质与未蛋白质与未标记的竞争标记的竞争DNA结合结合凝胶电泳凝胶电泳放射自显影放射自显影蛋白质与标蛋白质与标记的探针记的探针DNA结合结合95 可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。96 凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而足迹实验可以解决这个问题97

37、足迹实验足迹实验（footprintingfootprinting assay assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。9832p1 5 101 5 101 4 8 101 4 8 10加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510A BA B足迹足迹(a)(c)(b)DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验99 如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我

38、们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 100 硫酸二甲酯（DMS）足迹实验： DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。101甲基化干扰实验（甲基化干扰实验（methyltion interference assaymethyltion interference assay）根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异

39、切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。 102凝胶电泳凝胶电泳和和1034 4、体内足迹实验、体内足迹实验me硫酸二甲酯分离分离DNA并用并用六氢吡啶切割六氢吡啶切割应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验应用甲基化保护作用进行

40、的体内足迹实验104105基因芯片发展历史基因芯片发展历史106转录组学的研究方法转录组学的研究方法DNA芯片技术芯片技术107基因芯片技术流程 一、PCR技术原理 二、PCR技术主要类型 三、PCR技术主要应用第三节第三节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应108Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。一、一、PCRPCR技术原理技术原理109（一）（一）PCRPCR技术简史技术简史DNA

41、的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长110PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物111PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

42、35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶112PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：经过DNADNA变变性，与合适引物杂交，用性，与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可延伸引物，并不断重复该过程便可克隆克隆tRNAtRNA基因。基因。但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及7070年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技术的发明使克

43、隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，KhoranaKhorana的的设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了113PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人发明了聚等人发明了聚合酶链反应（合酶链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最初采用最初采用E-coliE-coli DNA DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，由于该酶，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热耐热DNAD

44、NA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCRPCR能高效率的进行，能高效率的进行，随后随后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循自动化热循环仪环仪19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖114 PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在许多作品中，包括1990年在科学美国人上的一篇文章，及1998年的自传心灵裸舞（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。115“顿悟顿悟” 那是在

45、1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。116PCRPCR技术的发明技术的发明 PCRPCR的发明是的发明是DNADNA操作技术的革命操作技术的革命 美国美国MullisMullis教授教授 开汽车时的联想开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路逶迤崎岖的山路 行驶的汽车行驶的汽车 19881988年发明了年发明了PCRPCR技术技术 19931993年获诺贝尔年获诺贝尔奖奖117118 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项

46、重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。119 国内复旦大学 1988 年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC51A/B 型 DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。120 PCR 发明不到 10 年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。1991 年，期刊“PCR 方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR 技术作为一种

47、方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。121 1993 年度诺贝尔化学将已于 10 月 13 日揭晓，Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用 PCR 检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR 方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同 DNA 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”一名加拿大籍英国科学家Michael Smith 因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与 Mullis 同享此荣。122引物引物引物引物123()40

48、50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20124125（二）（二）PCRPCR的基本原理的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先将待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。126127PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePCRP

49、CR原理示意图原理示意图模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；128PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；129PCR

50、 Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板- -引物引物结合物在结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为反应原为反应原料，靶序列为模料，靶序列为模板，按碱基配对板，按碱基配

51、对与半保留复制原与半保留复制原理，合成一条新理，合成一条新的与模板的与模板DNA DNA 链。链。130End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一每完成一个循环需个循环需2 24 4分钟，分钟， 2 23 3小时小时就能将待就能将待扩目的基扩目的基因扩增放因扩增放大几百万大几百万倍。倍。131Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266

52、4201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon132（三）（三）PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应条件：10X10X缓冲液缓冲液 10 10 L L4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol

53、100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L133PCRPCR仪仪134PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点1351234522557294时间（min）温度（）PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍136模板DNA95137PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的

54、特点50引物1引物2DNA引物138PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶139PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始140PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq141PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束142PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+

55、x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 143PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高灵敏度高1. 1. 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平水平2. 2. 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3. 3. 病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU（空斑形成单位）（空斑形成单位）4. 4. 细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1. 1. 一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小

56、时完成扩增小时完成扩增2. 2. 扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提组织的粗提DNADNA144标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至 100ul（四）（四）PCRPCR反应体系反应体系1451 1、PCRPCR反应五要素（反应成分）反应五要素

57、（反应成分）1) 引物（primers）2) 酶 （Taq DNA polymerase） 3) dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4) 模板 （template） 5) Mg2+ （magnesium）1461 1）引物）引物理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增147引物设计的原则引物设计的原则引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物特异性引物扩增跨度：以500bp为

58、宜 特定条件下可扩增长至10kb片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列148引物设计的原则引物设计的原则避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带引物3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处引物设计的原则引物设计的原则引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它

59、序列无明显同源性引物量： 每条引物的浓度0.2 1umol，以最低引物量产生所需结果为佳 引物浓度偏高会导致错配和非特异性扩增，且又增加引物之间形成二聚体的机会150GenBank网址：网址： 使用使用Blast程序，输入引物序列，等待结果报告程序，输入引物序列，等待结果报告151引物设计网址引物设计网址/cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi152 DNAstar Primer premierSoftware for primer design依靠经验直接设计依靠

60、经验直接设计1532）酶及其浓度）酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应 天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少1543）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。1554 4）模板）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA