酶的非水相催化

1、Chapter 6 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system酶的非水相催化酶的非水相催化退出酶的非水相催化酶的非水相催化n酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化（enzyme non-aqueous catalysis，enzyme catalysis in non-aqueous phase）n通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改进酶的催化活性。退出Contents of chapter 61、酶催化反应的介质2、有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 GoG

2、oGoGo5、酶非水相催化的应用 Go退出6.1 酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化

3、反）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应体系中进行催化反应。退出酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够

4、发挥其催化功能。气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。 离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。离子液（离子液（ionic liquidsionic liquids）是由有机）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类阳离子与有机（无机

5、）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 本章目录退出 超临界流体n当一种物质处于其临界点以上的温度和压力当一种物质处于其临界点以上的温度和压力之下，则称之为之下，则称之为超临界流体超临界流体。n临界温度临界温度：高于此温：高于此温度时，无论加压多大，度时，无论加压多大，也不能使气体液化；也不能使气体液化；n临界压力临界压力：在临界温：在临界温度下，液化气体所需度下，液化气体所需的压力。的压力。退出6.2 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 6.2.1有机介质反应体系 n非极性有

6、机溶剂非极性有机溶剂酶悬浮体系酶悬浮体系( (微水介质体系微水介质体系) )用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。n与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂水单相体系水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 n非极性有机溶剂非极性有机溶剂水两相水两相/ /多相体系多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。n正胶束体系和反胶束体系正胶束体系和反胶束体系不管采用何种有机介质

7、反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 退出退出6.2.2 反应体系中水对酶催化反应的影响反应体系中水对酶催化反应的影响n酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成水是不可缺少的成分分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象空间构象、酶的催化活性催化活性、酶的稳定性稳定性、酶的催化反应速度催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度底物和反应产物的

8、溶解度有关。 n（1 1）水对酶分子空间构象的影响）水对酶分子空间构象的影响：酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential wateressential water）。n为了维持其空间构象而进行正常的催化反应，不同的酶所要求的必为了维持其空间构象而进行正常的催化反应，不同的酶所要求的必需水差别很大。例如：脂肪酶只需要几个分子的水；凝乳蛋白酶分需水差别很大。例如：脂肪酶只

9、需要几个分子的水；凝乳蛋白酶分子在辛烷中需子在辛烷中需5050分子的水，在其它溶剂中需要更少的水，而多酚氧分子的水，在其它溶剂中需要更少的水，而多酚氧化酶则需要化酶则需要350350个水分子的水，才能显示其催化活性。个水分子的水，才能显示其催化活性。退出（2 2）水对酶催化速度的影响）水对酶催化速度的影响n与酶分子表面紧密结合的一单层水分子，与酶分子表面紧密结合的一单层水分子，对酶的催化活性是至关重要的。对酶的催化活性是至关重要的。n图图1表示猪胰脂肪酶催化甘油三丁酸酯和正表示猪胰脂肪酶催化甘油三丁酸酯和正庚醇的转酯化反应速度与有机介质中含水庚醇的转酯化反应速度与有机介质中含水量的关系。量的关

10、系。n有机介质中水的含量对酶催化反应速度有有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著的影响，在含水量较低的条件下，显著的影响，在含水量较低的条件下，酶酶的催化反应速度随水含量的增加而升高的催化反应速度随水含量的增加而升高，在催化反应速度达到最高时的含水量称为在催化反应速度达到最高时的含水量称为最适含水量最适含水量。n最适含水量，包括酶分子水合的必需水，最适含水量，包括酶分子水合的必需水，有机介质水合，固定化酶载体水合等所需有机介质水合，固定化酶载体水合等所需的水量。因此，即使采用相同的酶，催化的水量。因此，即使采用相同的酶，催化同一种反应，反应体系的最适含水量也会同一种反应，反应体系的最适含水量

11、也会随着有机溶剂的种类，固定化酶载体的特随着有机溶剂的种类，固定化酶载体的特性等变化而有所差别。性等变化而有所差别。图图1 反应速度与有机介质中含水量的关系反应速度与有机介质中含水量的关系退出n在实际工作中，应根据实际情况，通过实验确定最适含水量。在实际工作中，应根据实际情况，通过实验确定最适含水量。溶剂的极性越强，最适含水量越高。如胰凝乳蛋白酶在二异丙溶剂的极性越强，最适含水量越高。如胰凝乳蛋白酶在二异丙醚、二氯乙烷或氯仿中最适含水量为醚、二氯乙烷或氯仿中最适含水量为1%；在极性较弱的甲苯；在极性较弱的甲苯中，只要中，只要0.5%的含水量就可达到最大酶活力；而在极性较强的含水量就可达到最大酶

12、活力；而在极性较强的乙酸乙酯中则要求较高的含水量。人们认为，酶要与有机溶的乙酸乙酯中则要求较高的含水量。人们认为，酶要与有机溶剂互相争夺水分子，各自维持必要的水合状态。剂互相争夺水分子，各自维持必要的水合状态。实验表明，有实验表明，有时太多的水会使酶的活性降低。时太多的水会使酶的活性降低。其中一个原因是，水分子在活其中一个原因是，水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽作用，掩盖了活性位点的性位点之间形成水束，通过介电屏蔽作用，掩盖了活性位点的极性；另一个原因是，太多的水（在有机相中）会使酶积聚成极性；另一个原因是，太多的水（在有机相中）会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起

13、传质阻力。还团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起传质阻力。还有一种说法是，有机溶液中酶含水量低于最适含水量时，酶构有一种说法是，有机溶液中酶含水量低于最适含水量时，酶构象过于刚性而失去催化活性；含水量高于最适含水量时，酶结象过于刚性而失去催化活性；含水量高于最适含水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活。只有在最适水量时蛋白质结构化，引起酶结构的改变和失活。只有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点，酶表现出的动力学刚性和热力学稳定性之间达到最佳平衡点，酶

14、表现出最大活力。有些膜酶在水溶液中反而不稳定。最大活力。有些膜酶在水溶液中反而不稳定。退出6.2.3 反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响1有机溶剂对酶结构和功能的影响n常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。但并非所有的酶悬浮并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象、保持酶活性。于任何有机溶剂中都能维持其天然构象、保持酶活性。 n在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。n根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持

15、其空根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别间结构完整性的情况也有所差别。 （1）有一些酶在有）有一些酶在有机溶剂的作用下，其机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏空间结构会受到某些破坏，从而使，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。例如，酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。例如，碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中24小时，小时，60%的酶将不的酶将不可逆地变性失活；（可逆地变性失活；（2）有一些酶在有机溶剂中，其整）有一些酶在有机溶剂中，其整个空间结构和活性中心个空间结构和活性中心基本保持完整基本保持完整，能够在适当

16、有机，能够在适当有机介质中进行催化反应。如蛋白酶、脂肪酶、多酚氧化酶、介质中进行催化反应。如蛋白酶、脂肪酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、异构酶等。但也可能过氧化物酶、异构酶等。但也可能对酶的表面结构和活对酶的表面结构和活性中心产生影响性中心产生影响。退出2.2.有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响n有机溶剂的极性大小对酶促反应影响很大。有机溶剂的极性的强有机溶剂的极性大小对酶促反应影响很大。有机溶剂的极性的强弱用极性系数弱用极性系数lg P表示。表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小，极性系数越小，则极性系数。极性系数越大

17、，表明其极性越小，极性系数越小，则极性越强。越强。n极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。n亲水性有机溶剂可以夺走酶分子表面的必需水，破坏维护酶蛋白亲水性有机溶剂可以夺走酶分子表面的必需水，破坏维护酶蛋白结构的氢键、离子键等次级键，降低了酶的活性、稳定性。结构的氢键、离子键等次级键，降低了酶的活性、稳定性。n有机溶剂的极性越强，越易于夺取酶分子表面的结合水，对酶的有机溶剂的极性越强，越易于夺取酶分子表面的结合水，对酶的活性的影响就越大。例如：正己烷能夺取酶分子活性的影响就越大。例如：正己烷能夺取酶分子0.

18、5%的结合水，的结合水，甲醇则可以夺取酶分子甲醇则可以夺取酶分子60%的结合水。的结合水。n因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性影响其催化活性。 退出3.有机溶剂对酶作用底物和产物的影响n有机溶剂可以直接与底物、产物分子进行反应，或者可以通过底物和产物在水相和有机相的分配，从而影响其在酶分子表面的水层中浓度来改变酶的活性。n酶在有机介质中进行催化反应时，酶的作用底物首先必须进入酶的水化层，然后才能进入酶的活性中心进行催化反应。反应后生成的产物也首先要分布在酶的水化层中，然

19、后才能从必需水层转移到有机溶剂中，产物必须移出必需水层，酶促反应才可能继续进行下去。n有机溶剂能够改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。有机溶剂的极性系数lg P大于5（极性很小): 疏水性底物难以从有机溶剂中进入必需水层。有机溶剂的lg P小于2（极性过大）：疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低，底物浓度降低，也会使催化速度减慢。本章目录退出6.3 酶在有机介质中的催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性n底物特异性底物特异性n立体选择性立体选择性n区域选择性区域选

20、择性n键选择性键选择性n热稳定性热稳定性退出n在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。n例如，胰蛋白酶等蛋白酶在催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯的水解反应时，由于苯丙氨酸的疏水性比丝氨酸强，所以，酶在水溶液中催化苯丙氨酸酯水解的速度，比在同等条件下催化丝氨酸酯水解的速度高104 倍；而在辛烷介质中，催化丝氨酸酯水解的速度却比催化苯丙氨酸酯水解的速度快20倍。n在水溶液中，底物与酶分子活性中心的结合主要依靠疏水作用，所以疏水性较强的底物，容易与活性中心部位结合，催化反应的速度较高；而在有机介质中有机溶剂与底

21、物之间的疏水作用比底物与酶之间的疏水作用更强。结果疏水性较强的底物容易受有机溶剂的作用，反而影响其与酶分子活性中心的结合。46.3.1 底物专一性退出n不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。一般说来，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。n例如，枯草杆菌蛋白酶催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在极性较弱的二氯甲烷或者在苯介质中，含丝氨酸的底物优先反应；而在极性较强的吡啶或季丁醇介质中，则含苯丙氨酸的底物首先发生转酯反应。退出n6.3.2 6.3.2 对

22、映体选择性对映体选择性n酶的对映体选择性酶的对映体选择性（enantioselectivity）又称为立体选择性或立体异）又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。的指标。n酶立体选择性的强弱可以用酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数（立体选择系数（KLD）的大小来衡量。立的大小来衡量。立体选择系数与酶对体选择系数与酶对L-型和型和D-型两种异构体的酶转换数（型两种异构体的酶转换数（Kcat）和米氏）和米氏常数（常数（Km）有关，）有关，n即：即：n式中，式中，KLD为立体选择系数；为

23、立体选择系数；L为为L-型异构体；型异构体；D为为D-型异构体；型异构体；Km为米氏常数，即酶催化反应速度达到最大反应速度为米氏常数，即酶催化反应速度达到最大反应速度半时的底物浓度；半时的底物浓度；Kcat为酶的转换数，是酶催化效率的一个指标，指每个酶分子每分钟为酶的转换数，是酶催化效率的一个指标，指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。催化底物转化的分子数。n立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。DmcatLmcatLD)K/K()K/K(K退出n酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性

24、也发生改变。例如，胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶在有机介质中催化N-乙酰丙氨酸氯乙酯（N-AC-Ala-O-EtCl）水解的立体选择系数KLD10，而在水溶液中KLD=10 3 -10 4 ，相差100-1000倍。n酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。例如，蛋白酶在水溶液中只对含有L-氨基酸的蛋白质起作用，水解生成L-氨基酸。而在有机介质中，某些蛋白酶可以用D-氨基酸为底物合成由D-氨基酸组成的多肽等。这一点在手性药物的制造中，有重要应用。34退出n6.3.3 6.3.3 区域选择性区域选择性n酶在有机介质中进行催化时，具有酶在有机

25、介质中进行催化时，具有区域选择性区域选择性（regioselectivity），即），即酶能够选择底物分子中某一区域的基团酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。优先进行反应。n酶区域选择性的强弱可以用酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数区域选择系数Krs的大小来衡量。区域的大小来衡量。区域选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置1，2代替异构体的构型代替异构体的构型L，D。n即即n K1,2= (Kcat / Km)1 / (Kcat / Km)2n例如，用脂肪酶催化例如，用脂肪酶催化1,4-二丁酰基二丁酰基-2-辛基苯

26、与丁醇之间的转酯反辛基苯与丁醇之间的转酯反应，在应，在甲苯介质甲苯介质中，区域选择系数中，区域选择系数K4,1=2，表明，表明酶优先作用于底酶优先作用于底物物C-4位上的酰基位上的酰基；而在；而在乙腈介质乙腈介质中，区域选择系数中，区域选择系数K4,1=0.5，则，则表明酶表明酶优先作用于底物优先作用于底物C-1位上的酰基位上的酰基。从中可以看到，在两种不。从中可以看到，在两种不同的介质中，区域选择系数相差同的介质中，区域选择系数相差4倍。倍。退出n6.3.4 6.3.4 键选择性键选择性n酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化化学键选择性学

27、键选择性，即在同一个底物分子中有，即在同一个底物分子中有2种以上的化学种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。反应。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。n例如，脂肪酶催化例如，脂肪酶催化6-氨基氨基-1-己醇的酰化反应，底物分己醇的酰化反应，底物分子中的氨基和羟基都可能被酰化，分别生成肽键和酯子中的氨基和羟基都可能被酰化，分别生成肽键和酯键。当采用黑曲霉脂肪酶进行催化时，羟基的酰化占键。当采用黑曲霉脂肪酶进行催化时，羟基的酰化占绝对优势；而采用毛霉脂肪酶催化时，则优先使氨基绝对优势

28、；而采用毛霉脂肪酶催化时，则优先使氨基酰化。研究表明，酰化。研究表明，在不同的有机介质中，氨基的酰化在不同的有机介质中，氨基的酰化与羟基的酰化程度也有所不同与羟基的酰化程度也有所不同。退出6.3.5 热稳定性热稳定性n许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。性更好。例如，胰脂肪酶在水溶液中，例如，胰脂肪酶在水溶液中，100时很快失活；时很快失活；而在有机介质中，在相同的温度条件下，半衰期却长达而在有机介质中，在相同的温度条件下，半衰期却长达数小时。胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中，于数小时。胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中，于20保存保存5个月个

29、月仍然可以保持其活性；而在水溶液中，其半衰期却只有仍然可以保持其活性；而在水溶液中，其半衰期却只有几天。几天。n酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低。例如，核糖核酸酶在有机介质中的水含量从低。例如，核糖核酸酶在有机介质中的水含量从0.06g/g蛋白质增加到蛋白质增加到0.2g/g蛋白质时，酶的半衰期从蛋白质时，酶的半衰期从120min减减少到少到45min。细胞色素氧化酶，在甲苯中的水含量从。细胞色素氧化酶，在甲苯中的水含量从1.3%降低

30、到降低到0.3%，半衰期从，半衰期从1.7min增加到增加到4h。退出n在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。因为水分子会引起酶因为水分子会引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用，还可能会引起天冬氨分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用，还可能会引起天冬氨酸肽键的水解、半胱氯酸的氧化、二硫键的破坏等，所以，酶分酸肽键的水解、半胱氯酸的氧化、二硫键的破坏等，所以，酶分子在水溶液中热稳定性较差，而在含水量低的有机介质中，酶分子在水溶液中热稳定性较差

31、，而在含水量低的有机介质中，酶分子的热稳定性显著提高。子的热稳定性显著提高。n某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性如下表所示。某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性如下表所示。退出酶酶介质条件介质条件热稳定性热稳定性猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯水，水，pH7.0T1/226hT1/22min酵母脂肪酶酵母脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯/庚醇庚醇水，水，pH7.0T1/2=1.5hT1/22min脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯，甲苯，90，400h活力剩余活力剩余40%胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100水，水，pH8.0，55T1/2=80minT1/2=15min枯草杆

32、菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶正辛烷，正辛烷，110T1/2=80min核糖核酸酶核糖核酸酶壬烷，壬烷，110，6h水，水，pH8.0，90活力剩余活力剩余95%T1/210min酸性磷酸酶酸性磷酸酶正十六烷，正十六烷，80水，水，70T1/2=8min T1/2=1min某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性退出酶酶介质条件介质条件热稳定性热稳定性限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（Hind ）正庚烷，正庚烷，55，30d活力不降低活力不降低-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶2-丙醇，丙醇，50，30h活力剩余活力剩余80%溶菌酶溶菌酶环己烷，环己烷，110水水T1/2=140

33、min T1/2=10min酷氨酸酶酷氨酸酶氯仿，氯仿，50水，水，50T1/2=90min T1/2=10min醇脱氢酶醇脱氢酶正庚烷，正庚烷，55T1/250d细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶甲苯，甲苯，0.3%水水甲苯，甲苯，1.3%水水T1/2=4.0hT1/2=1.7min退出n6.3.6 pH印记印记n在水溶液中，在水溶液中，pH值是影响酶催化的重要因素。因为在水溶值是影响酶催化的重要因素。因为在水溶液中，缓冲液的液中，缓冲液的pH值决定了酶分子活性中心基团的解离状值决定了酶分子活性中心基团的解离状态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和催态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底

34、物的结合和催化反应。化反应。而在有机溶剂中，不存在质子获得或者丢失的条而在有机溶剂中，不存在质子获得或者丢失的条件，那么，在有机介质中，件，那么，在有机介质中，pH值是如何影响催化反应？值是如何影响催化反应？n研究结果表明，研究结果表明，在有机介质反应中，酶所处的在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同。值相同。这这种现象称之为种现象称之为pH印记（印记（pH-imprinting）或称为）或称为pH记忆记忆。因为酶在冻干或吸附到载体之前，先置于一定因为酶在冻干或吸附到载体之前，先置于一定pH值的缓冲值

35、的缓冲液中，缓冲液的液中，缓冲液的pH决定了酶分子活性中心基团的解离状态。决定了酶分子活性中心基团的解离状态。当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态保当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态保持不变，酶分子保留了原有的持不变，酶分子保留了原有的pH印记，即是说印记，即是说酶分子在缓酶分子在缓冲液中所处的冲液中所处的pH状态仍然被保持在有机介质中状态仍然被保持在有机介质中。退出n酶在有机介质中催化反应的最适酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液值通常与酶在水溶液中反应的最适中反应的最适pH值接近或者相同。值接近或者相同。利用酶的这种利用酶的这种pH印记印记特性，可以

36、通过控制缓冲液中特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的最适机介质中酶催化反应的最适pH值。有些研究也发现，有值。有些研究也发现，有些酶在有机介质中催化的最适些酶在有机介质中催化的最适pH值与水溶液中催化的最值与水溶液中催化的最适适pH值有较大差别，需要在实际应用时加以调节控制。值有较大差别，需要在实际应用时加以调节控制。n然而也有研究表明，在含有微量水的有机介质中，某些然而也有研究表明，在含有微量水的有机介质中，某些疏水性的酸与其相对应的盐组成的混合物，或者某些疏疏水性的酸与其相对应的盐组成的混合物，或者某些疏水性的碱与其相对应的盐组成的混合

37、物，可以作为水性的碱与其相对应的盐组成的混合物，可以作为有机有机相缓冲液相缓冲液（organic phase buffer）使用。它们以中性或）使用。它们以中性或者离子对的形式溶解于有机溶剂中，这两种存在形式的者离子对的形式溶解于有机溶剂中，这两种存在形式的比例控制着有机介质中酶的解离状态比例控制着有机介质中酶的解离状态。采用有机相缓冲。采用有机相缓冲液时，酶分子的液时，酶分子的pH印记特性不再起作用印记特性不再起作用，即是说，酶在，即是说，酶在冷冻干燥的前缓冲液的冷冻干燥的前缓冲液的pH值状态对酶在有机介质中的催值状态对酶在有机介质中的催化活性没有什么影响，而主要受到有机相缓冲液的影响。化活

38、性没有什么影响，而主要受到有机相缓冲液的影响。退出酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性刚性”特点。通过选择不同性质的溶剂来调控酶的通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关, , 因此在有机介质中因此在有机介质中酶的酶的稳定性得到显著提高稳定性得到显著提高。由于有机溶剂的存在由于有机溶剂的存在, , 水量减少，大大水量减少，大大

39、降低了许多需要水参与的副降低了许多需要水参与的副反应反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。在有机介质中进行的酶促反应，可以在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程省略产物的萃取分离过程, 提高收率。提高收率。有机介质酶催化反应的优点退出6.4 有机介质中酶催化反应的条件及其控制 n酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。n主要应控制的条件有q酶的种类和浓度q底物的种类和浓度q有机溶剂的种类q水含量q温度qpHq离子强度本章目录退出6.5 酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用 脂肪酶脂肪酶 肽合

40、成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各种酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化退出1.手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羟基苯哌嗪(Dropropizine)反应停（Thalidom

41、ide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速宁（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛尔（Kebivolol）S构型，治疗心脏病,-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S,S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失明左旋体，舒张血管1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢

42、动力学情况体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。 退出n例例1苯丙氨酸甲酯的拆分苯丙氨酸甲酯的拆分n苯丙氨酸的单一对映体及其衍生物，是半合成抗生素如头孢氨苯丙氨酸的单一对映体及其衍生物，是半合成抗生素如头孢氨苄、氨苄青霉素等的重要侧链。用脂肪酶在有机溶剂中通过酰苄、氨苄青霉素等的重要侧链。用脂肪酶在有机溶剂中通过酰化反应，可以将外消旋苯丙氨酸拆分为单一的对映体。化反应，可以将外消旋苯丙氨酸拆分为单一的对映体。n例例2环氧

43、丙醇衍生物的拆分环氧丙醇衍生物的拆分n2,3-环氧丙醇单一对映异构体的衍生物，是一种多功能手性分环氧丙醇单一对映异构体的衍生物，是一种多功能手性分子，用它可以合成抗艾滋病病毒的子，用它可以合成抗艾滋病病毒的HIV蛋白酶的抑制剂、抗病蛋白酶的抑制剂、抗病毒药物、毒药物、-受体阻断剂等多种手性药物。用猪胰脂肪酶，在有受体阻断剂等多种手性药物。用猪胰脂肪酶，在有机溶剂中，对环氧丙醇衍生物消旋体已成功地进行拆分，获得机溶剂中，对环氧丙醇衍生物消旋体已成功地进行拆分，获得了单一对映体。了单一对映体。退出脂肪酶-消旋化合物的拆分乙酸异丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+RCOOCH3OAcRC

44、OOCH3OHRCOOCH3OHRCOOCH3OAcRCOOCH3OH有机溶剂有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羟基-,-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。退出n2、糖和甾体的选择性酰化、糖和甾体的选择性酰化n糖类是一种多羟基化合物，对其羟基进行选择性酰化糖类是一种多羟基化合物，对其羟基进行选择性酰化制备的糖脂，是高效无毒非离子型表面活性剂。糖类制备的糖脂，是高效无毒非离子型表面活性剂。糖类的特殊结构，还可合成糖聚酯等化工材料。但糖羟基的特殊结构，还可合成糖聚酯等化工材料。但糖羟基多，选择性酰化（酯化），是有机化学中的难题之一，多，选择性酰化（酯化），是有机化学中的难题之一，利用生

45、物催化剂的高效选择性反应，可以解决此类问利用生物催化剂的高效选择性反应，可以解决此类问题。糖的亲水性，使其只能在少数亲水性有机溶剂，题。糖的亲水性，使其只能在少数亲水性有机溶剂，如吡啶、二甲基甲酰胺中进行反应。研究表明，猪胰如吡啶、二甲基甲酰胺中进行反应。研究表明，猪胰脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶，能够在这种溶剂中完成选脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶，能够在这种溶剂中完成选择性催化。择性催化。n甾体是多环化合物，不同位点的羟基酰化也是很困难甾体是多环化合物，不同位点的羟基酰化也是很困难的。应用粘质色杆菌脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶可以分的。应用粘质色杆菌脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶可以分别使别使3-位和位和17-位羟基

46、进行选择性酰化。位羟基进行选择性酰化。退出n3、肽合成、肽合成n多肽是一些药物、毒物、甜剂的成分或前体。用化学方法合成多肽是一些药物、毒物、甜剂的成分或前体。用化学方法合成很复杂，酶法合成较简便，特别是有机溶剂中水解酶可以催化很复杂，酶法合成较简便，特别是有机溶剂中水解酶可以催化逆反应，使其更具有实用价值。酶催化肽合成有逆反应，使其更具有实用价值。酶催化肽合成有3种方法：水种方法：水解逆反应、转肽反应和酯氨解反应。现已有一些应用的实例。解逆反应、转肽反应和酯氨解反应。现已有一些应用的实例。退出n（1）阿斯巴甜的合成）阿斯巴甜的合成n阿斯巴甜（阿斯巴甜（aspartame）是一种甜味二肽，甜度为

47、蔗糖的）是一种甜味二肽，甜度为蔗糖的150倍倍200倍，低热值，在人体内代谢不需胰岛素参与，特别适宜糖倍，低热值，在人体内代谢不需胰岛素参与，特别适宜糖尿病人和肥胖患者使用。用嗜热杆菌蛋白酶在有机溶剂中，利用尿病人和肥胖患者使用。用嗜热杆菌蛋白酶在有机溶剂中，利用水解逆反应，以水解逆反应，以L天冬氨酸（天冬氨酸（L-Asp）和）和L-苯丙氨甲酯（苯丙氨甲酯（L-Phe-Ome）为底物，可合成此二肽。）为底物，可合成此二肽。nZ=Ph-CH2-O-CO-（即是苄氧羰基），为氨基酸氨基端的保护剂。（即是苄氧羰基），为氨基酸氨基端的保护剂。Z-Asp+2Phe-Ome嗜热菌蛋白酶Z-Asp+Phe-

48、Ome Phe-Ome*纯化Z-Asp+Phe-Ome Asp-Phe-Ome脱保护基退出n（2）青霉素前体肽的合成）青霉素前体肽的合成n青霉素和头孢霉素分子结构的核心部分，是由青霉素和头孢霉素分子结构的核心部分，是由-（L-氨基己酰）氨基己酰）-L-半胱氨酰半胱氨酰-D-缬氨酸三肽合成的。用脂缬氨酸三肽合成的。用脂肪酶在有机溶剂中可以催化此三肽合成。三肽作为青肪酶在有机溶剂中可以催化此三肽合成。三肽作为青霉素等发酵生产的前体物质，可以提高这类抗生素的霉素等发酵生产的前体物质，可以提高这类抗生素的产率。产率。退出应应 用用例例 子子所用酶（或细胞）所用酶（或细胞）有有机机合合成成氧化氧化光学活

49、性物质的合成光学活性物质的合成油和脂肪的精制油和脂肪的精制生物表面活性剂的合成生物表面活性剂的合成肽的合成肽的合成其他的专一性合成其他的专一性合成化学分析化学分析聚合聚合解聚解聚外消旋混合物的分离外消旋混合物的分离甾族化合物的氧化甾族化合物的氧化环氧化环氧化脂肪族的羟基化脂肪族的羟基化芳香族的羟基化芳香族的羟基化醇、酮醇、酮羧酸及其酯羧酸及其酯氰醇氰醇棕榈油转化为可可油棕榈油转化为可可油脂肪水解脂肪水解青霉素青霉素G前体肽的合成前体肽的合成甜蜜素双肽的合成甜蜜素双肽的合成肽链中插入肽链中插入D-氨基酸氨基酸由由X-Ala-Phe-Ome和和Leu-NH2在已烷在已烷中（反应物、产物均匀不溶）合成肽中（反应物、产物均匀不溶）合成肽甘醇的酰基化甘醇的酰基化糖在无水糖在无水DMF中的酰基化中的酰基化醇、甘油衍生物、糖和有机金属化合醇、甘油衍生物、糖和有机金属化合物的合成物的合成胆固醇的测定胆固醇的测定酚的测定酚的测定酚的聚合酚的聚合二酯和二醇的选择性聚合二酯和二醇的选择性聚合木质素解聚木质素解聚酸的外消旋混合物酸的外消旋混合物醇的外消旋混合物醇的外消旋混