酶学基础三PPT课件

1、酶促反应的机制1. 酶底物复合物的形成(1)(1)中间产物学说：中间产物学说： E+S ES E+P(2) 酶与底物结合特点：酶与底物结合特点： 1）可逆的、非共价的结合；）可逆的、非共价的结合； 2）底物只与酶的活性中心结合；）底物只与酶的活性中心结合； 3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契）酶与底物结合是通过一种称为诱导契合模式进行的。合模式进行的。 k1 k-1k2第1页/共34页第2页/共34页活化能活化能：在一定温在一定温度下，度下，1mol1mol底物底物全部进入全部进入活化状态活化状态所需的自所需的自由能，单由能，单位位J/molJ/mol。E+SP+ EES能量水平反应过程 G

2、 E1 E2S本本本课课课件件件由由由西西西华华华大大大学学学生生生物物物工工工程程程学学学院院院车车车振振振明明明制制制作作作 第3页/共34页第4页/共34页3 3、影响酶催化的有关因素、影响酶催化的有关因素(1)(1)底物与酶的靠近及定向底物与酶的靠近及定向(2) (2) “张力张力”和和“形变形变”(3) (3) 酸碱催化酸碱催化(4) (4) 共价催化共价催化(5) (5) 金属离子催化作用金属离子催化作用第5页/共34页 在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应

3、速度；的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。率和专一性特点。3 3、影响酶催化的有关因素、影响酶催化的有关因素(1)(1)底物与酶的靠近及定向底物与酶的靠近及定向第6页/共34页临近效应第7页/共34页定向效应第8页/共34页(2) (2) “张力张力”和和“形变形变” 底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变底物与酶

4、结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力张力”甚至甚至“形变形变” ，从而促使酶底物中间产物进，从而促使酶底物中间产物进入过渡态入过渡态。第9页/共34页第10页/共34页(3) (3) 酸碱催化：酸碱催化： 一般都是广义的酸碱催化方式。一般都是广义的酸碱催化方式。 广义酸碱催化是指通过质子酸提广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子供部分质子, ,或是通过质子碱接受部分或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的质子的作用，达到降低反应活化能的过程。过程。 -COOH, -NH3, -SH,+OHNHNH+-COO , -

5、NH2, -S , -.-O-NHN:广义氢的供体广义氢的受体第11页/共34页组氨酸的咪唑基：组氨酸的咪唑基：（1 1） pIpI值约为值约为6.7-7.16.7-7.1，在接近中性的，在接近中性的条件下，一半以广义酸的形式存在，条件下，一半以广义酸的形式存在，另一半以广义碱的形式存在，因而它另一半以广义碱的形式存在，因而它既能作为质子供体，又能作为质子受既能作为质子供体，又能作为质子受体，有效地进行酸碱催化。体，有效地进行酸碱催化。（2 2）咪唑基供出和接受质子的速度很）咪唑基供出和接受质子的速度很快，其半衰期短，小于快，其半衰期短，小于0.10.1毫微秒。所毫微秒。所以许多酶活性中心都有

6、组氨酸残基。以许多酶活性中心都有组氨酸残基。第12页/共34页酶分子中可作为酸碱催化的功能基团酶分子中可作为酸碱催化的功能基团第13页/共34页(4) (4) 共价催化共价催化 某些酶在催化过程中，能通过共价某些酶在催化过程中，能通过共价键与底物结合成不稳定的酶键与底物结合成不稳定的酶- -底物复底物复合物，这个中间产物很容易变成过渡合物，这个中间产物很容易变成过渡中间物，反应的活化能大大降低。中间物，反应的活化能大大降低。第14页/共34页 1 1）亲核催化）亲核催化 指酶分子中具有非共用电子对的指酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击底物分子中具有部分正亲核基团攻击底物分子中具有部分正电性

7、的原子，并与之作用形成共价键电性的原子，并与之作用形成共价键而产生不稳定的过渡态复合物，活化而产生不稳定的过渡态复合物，活化能降低。能降低。 2 2）亲电催化）亲电催化亲电基团亲电基团：ZnZn2+2+ 、FeFe3+3+ 、MgMg2+2+ 等等第15页/共34页第16页/共34页(5) (5) 金属离子催化作用金属离子催化作用 金属离子可以和水分子的金属离子可以和水分子的OH-OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。结合，使水显示出更大的亲核催化性能。 提高水的亲核性能提高水的亲核性能 第17页/共34页 电荷屏蔽作用电荷屏蔽作用v电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。 多种激酶(

8、(如磷酸转移酶) )的底物是MgMg2+2+-ATP-ATP复合物。 AHHOHHOHHO-OPOPOPOCH2OOOOOOMg2+第18页/共34页酶催化机理的实例酶催化机理的实例( (一一)E)E的特点的特点胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶: (EC3.4.4.5): (EC3.4.4.5)1.2411.241个个AAAA残基组成，分子量残基组成，分子量25000250002.2.专一性专一性AAAAAAAAAAAAAAAA1 1 AA AA2 2AAAAAAAAAA AA N N端端 芳香族芳香族AA CAA C端端3.3.活性中心活性中心Ser195, His57, Asp102Ser195,

9、 His57, Asp102，构成一个氢键，构成一个氢键 体系体系, His57, His57成为桥梁。成为桥梁。第19页/共34页（二）作用机理（二）作用机理1. 1.通过电荷转移，使通过电荷转移，使SerSer有更强的亲核力；有更强的亲核力；2. 2. 放出产物放出产物P P1,N1,N末端末端；3. 3. 形成产物形成产物P P2 2， C C 末端末端；底物结合底物形成共价ES复合物第20页/共34页His57 质子供体C-N键断裂R-NH2氨基产物释放水亲核攻击第21页/共34页H2O四面体中间物的瓦解羧基产物释放胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶催化反应酶催化反应的详细机制的详细机制第22页/

10、共34页后续酶催化反应的某些缺点后续酶催化反应的某些缺点 第23页/共34页1.3.1.3.酶活力的概念及其测定酶活力的概念及其测定（一）酶活力的概念及表示方法（一）酶活力的概念及表示方法1.1.概念：概念： 检测酶含量及存在，很难直接用检测酶含量及存在，很难直接用酶的酶的“量量”（质量、体积、浓度）来（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示能力来表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化学反应的能力称酶活酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度

11、来确定。化的化学反应的速度来确定。第24页/共34页 活力单位：活力单位：规定条件（最适条件）下规定条件（最适条件）下，一定时间内催化完成一定化学反应量所，一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。需的酶量。 国际单位（国际单位（U U）: :指在指在最适最适条件下，条件下，1 1分钟分钟内催化内催化1 1微摩尔微摩尔(umol)(umol)底物的底物的酶量酶量，或，或是转化是转化1 1微摩尔微摩尔(umol)(umol)底物中的有关基团的底物中的有关基团的酶量。酶量。 KatalKatal：指在最适条件下，每秒钟催化指在最适条件下，每秒钟催化1mol1mol底物转化所需的酶量。简称底物转化

12、所需的酶量。简称KatKat。2.2.酶活力的表示方法酶活力的表示方法1Kat = 61Kat = 610107 7 U U第25页/共34页注意：p以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。p在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。第26页/共34页 习惯单位： 在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观，规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如：-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀

13、粉的酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1g纯化的DNA所需的酶量。第27页/共34页3.3.酶的比活力酶的比活力酶的比活力：是指单位重量的蛋白质酶的比活力：是指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，即每中所含的某种酶的催化活力，即每mgmg蛋白所含的酶活力单位或每蛋白所

14、含的酶活力单位或每kgkg蛋白中蛋白中所含的所含的KatKat数数。比活力是表示酶制剂纯比活力是表示酶制剂纯度的一个指标。度的一个指标。比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数= U(或或IU) / mg蛋白蛋白第28页/共34页实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。 回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力总活力=比活力总体积（总重量）第29页/共34页 终点法终点法: : 酶反应进行到一定时间后酶

15、反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。定产物或反应物量的变化。 动力学法动力学法: :连续测定反应过程中产连续测定反应过程中产物物 底物或辅酶的变化量，直接测定出底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶反应的初速度。（二）酶活力的测定（二）酶活力的测定第30页/共34页测定初速度测定初速度最适条件最适条件S S EE要求要求斜率=P/ t = V（初速度）Pt第31页/共34页酶活力的测定的具体方法1）比色法 适用于酶的催化产物与特定物质反应生成有色的溶适用于酶的催化产物与特定物质反应生成有色的溶液液2）分光光度法）分光光度法 产物吸光度值与底物不同产物吸光度值与底物不同3）滴定法）滴定法4）量气法）量气法5）同位素测定法）同位素测定法6）酶偶联分析法）酶偶联分析法葡萄糖O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸H2O2H2O2+4-氨基安替吡林过氧化物酶H2O +醌类化合物在500nm处测定光密度第32页/共34页酶活力的测定：酶活力的测定： 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液；配制成一定浓度的底物溶液； 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温根