生化分离实验题目

1、2009生化分离工程实验（闭卷考试）一、简答题1. 在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO？2. 索氏提取装置由哪几部分组成？（画图）3. 咖啡因升华过程中用到了什么装置？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？4. 茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？5. 动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？6. 动物脏器DNA提取实验中，如何鉴定DNA的纯度？7. 动物脏器DNA提取实验中，RNA是怎样去除的？8. 动物脏器DNA提取实验中，氯仿-异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？9. 动物脏器DNA提取实验中，为什么用0.1M NaCl-SSC间歇式的搅拌猪肝？10. 离子交换

2、层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？11. 鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用树脂是哪种？树脂为什么预处理，如何预处理？12. DEAE-纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE-纤维素（OH型）？13. 在鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中固定相、流动相分别是什么？14. 简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图。15. 离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），为什么提取液的pH在3.5左右？16. 离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下半部），pH6.5的用意何在？17. 简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理18. 栀子黄提取实验中，

3、栀子苷是如何去除的？为什么用此方法去除？19. 栀子黄提取实验中，如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况？20. 栀子黄提取实验中，用什么设备去除的乙醇？吸附前为什么去除乙醇？21. 大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的？PBS与丙酮的作用分别是什么？22. 大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？其原理是什么？二、综合题23. 大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？并简要说明活性测定的原理、基本操作、注意事项及数据处理。24. 分析说明栀子黄色素提取实验中，藏花红素提取纯化的原理及关键步骤。25. 简要说明利用CTAB/异辛烷反胶团溶液萃取与反萃取甘薯中淀粉酶并测定前萃取率

4、及总萃取率（原理，步骤，结果处理与结论）26. 简要说明鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验（下半部）中，目标蛋白与杂质蛋白如何分离的。（说明原理、步骤、注意事项及所用设备组成图）1. 在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO? 答:吸取水分，防止咖啡因蒸汽溶于水； 中和鞣酸； 2. 索氏提取装置有哪几部分组成？（画图） 3. 咖啡因升华过程中用到了什么？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？ 答：用升华装置包括：蒸发皿、电热套、漏斗（滤纸、牙签、棉花） 注意：1.要控制好温度，始终都需用小火间接加热，如温度太高，会使产物发黄。 2. 漏斗颈部棉花松紧适宜。 3.滤纸的孔数适宜，也不能将滤纸放反了。 4.若漏

5、斗上有水蒸气应用滤纸擦干 4. 茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？ 答：旋转蒸发器、水浴锅、循环水式真空泵等 5.动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？ 答：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质， 6.动物脏器DNA提取实验中,如何鉴定DNA的纯度？ 答： DNA在紫外区有强吸收，最大吸收波长为260nm，而Pro在280nm处有强吸收， 若其中含有Pro，则A260/A280小于1.6，若含有RNA，则大于2.0，纯的DNA溶 液为1.8左右，据此可判断DNA纯度。 7.动物脏器DNA提取实验中,RNA是怎样去除的？ 答：在

6、浓NaCl溶液（12mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解 度很小；而在稀NaCl溶液（0.14mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核 蛋白的溶解度很大。将提取的细胞核物质先溶解与浓NaCl溶液中充分搅拌一定时 间后，加水稀释，降低DNA溶解度使DNA沉淀出来，倒去上清即除去RNA。 8.动物脏器DNA提取实验中,氯仿异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？ 答：氯仿异戊醇的作用使核蛋白乳化变性 分三层：上层为DNA和DNA核蛋白的水层 中间层为变性蛋白凝胶 下层为氯仿-异戊醇的有机溶剂层 9.动物脏器DNA提取实验中,为什么用0.1MNacl柠檬酸间歇式的搅拌猪

7、肝？ 答：与细胞等渗溶液，在搅碎时，保持细胞内外渗透压，防止细胞核破碎；间歇性搅拌 是为了避免搅碎细胞核（剪切力） 10.离子交换层析分离鸡卵粘蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？ 答：10%TCA去除杂蛋白 预冷丙酮沉淀黏蛋白以得粗提取物 鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用的树脂是哪种？树脂为什么预处理？如何预处理？ 答：1.DEAE纤维素树脂 2. 去除交换剂中存在的杂离子 使其充分溶胀 3. DEAE纤维素碱性溶液中浸泡一定时间洗至中性酸性溶液中浸泡一定 时间水洗至中性保存在缓冲溶液中备用 补充：对于OH型：先碱洗，再洗至中性，再酸洗，再洗至中

8、性。 对于H型：先酸洗，再洗至中性，再碱洗，再洗至中性 12.DEAE纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE纤维素（OH型） 答：是阴离子交换剂；对于OH型：先碱洗，再洗至中性，再酸洗，再洗至中性。 13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验中保持系统pH值稳定6.5左右用意何在？ 答：实验中用的离子层析柱，离子交换剂带正电荷，系统pH为6.5，能使目标蛋白带 负电，能与离子交换剂结合，使得杂蛋白带正电不能与离子交换剂结合，而使目标 蛋白与杂蛋白分离。 14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图? 答：恒流泵-离子交换柱-紫外检测仪-级分收集器 15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上

9、半部），为什么提取液的水在3.5左右？ 答：黏性Pro在pH3.5不发生沉淀，能维持它的稳定性，而使杂蛋白带正电，TCA自 身带负电，能与正电的杂蛋白结合使其变性，若pH再减小，TCA变形能力降低， 而且黏蛋白稳定性破坏，即3.5pH减少了目标pro的变性，增加了杂蛋白变性。 16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下半部）PH6.5的用意何在？ 答：洗脱杂蛋白质，使目标蛋白带负电，同时杂蛋白带正电（存在少量杂蛋白带负电） 17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理? 答:表面活性剂在有机相中自发形成反胶团，其内部有稳的水池，蛋白质溶解于小水池 中，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其

10、避免与有机溶剂接触而失活。 改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相(反萃)，实现了蛋白质的萃取分离、纯 化目的。 18.栀子黄色素提取实验中，栀子苷是如何去掉的？为什么用此方法去除? 答：D101是非极性吸附剂，在极性溶液中对溶质的吸附作用大，对栀子黄色素的吸附 能力强，改为70%乙醇时，溶液极性变小，非极性树脂吸附乙醇而洗脱出栀子黄色素，栀子苷因不能被吸附而被去除。 19.栀子黄色素提取实验中,如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况? 答：分光光度法；栀子黄色素水溶液在A238/A440的比值情况，当比值小于0.2时，可 以避免绿变现象。 20.大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的? 答：

11、大蒜滤液中加11.1倍体积去离子水，再分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙 醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置30min(4)，然后4000r/min 离心20min（5000rpm离心15min）除去变性蛋白沉淀，收集滤液，过滤（记录体 积，测酶活性核蛋白浓度） 补充：向大蒜的提取液中加入体积比为3:5的氯仿-乙醇溶液，边加边搅拌，使杂蛋白 变性，离心除去。 大题（四选一） 21.大蒜SOD提取实验中,用哪种方法测定SOD活性？并简要说明活性测定的原理，基本操作，注意事项以及数据处理？ 答：SOD抑制邻苯三酚的方法. 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2

12、 -，生成带色的中间产物， 反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是 因为生成的中间物不断氧化的结果。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与 H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求 出SOD的酶活性。 反应方程式： 基本操作：取3支试管（1号空白管,2号自氧化管，3号样品管），分别加入等 量Tris-HCl（pH8.2），保持相等溶液体积V1，以1号管为空白对照， 在2号中加入邻苯三酚，3号中加入邻苯三酚与V2SOD，分别测出在 波长325下的吸光值并作曲线求出斜率KA与KB 数据处理： 酶活（U/ml）=KAKBKA100%

13、50%V1V2 注意事项：液体配好后立即加入到比色皿中，等待1min开始测定吸光值 加入的量要精确 22. 设计实验从猪肝中提取RNA并鉴定其纯度。（原理，步骤，结果处理及结论） 原理：DNA在生物体内与蛋白质结合成核蛋白，因此提取出脱氧核糖核蛋白（DNP） 后，必须将其中蛋白质除去。在浓NaCl溶液（12mol/L）中，DNA核蛋白的 溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液（0.14mol/L）中， DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度 的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核 蛋白后，需进一步将蛋白质等

14、杂志除去（采用氯仿-异戊醇使其乳化变性）。 步骤：取猪肝，去结缔组织,加NaCl-柠檬酸钠间歇性搅拌，2层纱布过滤，离心，细胞核沉淀，在1.71NaCl充分搅拌，静置,用蒸馏水稀释（勿搅拌），静置（细胞核破碎），加NaCl固体粉末（RNA沉淀），静置，3000r/min离心，倒上清，将沉淀用0.14MNaCl充分溶解，转入三角瓶加氯仿-异戊醇（充分振荡），3000r/min离心,取上清加95%乙醇，将RNA沉淀挑取溶解鉴定。 结果处理：以0.14MNaCl为空白对照记录260nm和280nm下的吸光值。 结论：A260A280=1.8为标准，小于1.6则含有蛋白质；大于2.0含有DNA。 23

15、.设计实验利用CTAB/异辛烷反胶团溶液萃取与反萃取甘薯中淀粉酶，并测定前萃取率及总萃取率（原理，步骤，结果处理与结论） 原理：利用阳离子型表面活性剂CTAB在有机溶剂中形成反胶团来萃取-淀粉酶 （pI=5.0）。CTAB形成的反胶团内表面极性头带正电荷，当-淀粉酶带净负电荷 时，由于静电引力作用，使其被萃取进入反胶团内，反之则不能；另外高能度得 盐离子可与蛋白质竞争进入反胶团内，因此造成萃取下降。 步骤：反胶团溶液制备预处理萃取反萃取 反胶团制备：正丁醇60溶解后加入异辛烷混合，加0.5%NaCL缓慢加入，剧烈搅拌，离心取上相备用（反胶团溶液） 预处理：取甘薯匀浆溶液静置后过滤，离心，取上清

16、，分为两份（1号中加3M KCl作为原液，2号中加入0.5%NaCl作为萃取酶提取液。 萃取：2号中加入反胶团溶液振荡离心取上相（有机相） 反萃取：萃取后的上相加入到3M KCl（pH6.6），振荡离心取下相（试样） 酶活测定：取4只试管，依次编号（1号原液对照，2号原液，3号试样对照，4号 试样），在1号和4号中分别加入等量预热的原液和试样，再加入等量 的预热淀粉，40精确保温，4只管种分别加入DNS终止反应，1号与3 号中分别加入等量原液和试样，沸水浴显色后稀释，测在波长540下，以1号测出2号原液的吸光值A原，以3号测出4号试样的吸光值A样 结果处理：总萃取率=A样A原×100

17、% 结论:若答案为负值,则在操作过程总溶剂加错试管; 正确来说4只比色皿的颜色由深到浅顺序为2143 24.简要说明鸡卵黏蛋白离子交换层析提取实验（下半部）中，目标蛋白与杂质蛋白是如何分离的。（说明原理，步骤，注意事项及所用设备组成图） 原理：预处理使目标蛋白与交换离子带上相同的电荷,使杂质蛋白带上相反的电荷.离子交换剂上的交换离子能与之相同电荷的溶质发生交换,溶质通过静电作用于固定电荷结合而被吸附在离子交换剂上.待杂蛋白洗脱完毕后，用PBS使目标蛋白带上与交换离子相反的电荷，将目标蛋白洗脱出来。 步骤:样品预处理柱的填装柱的平衡上样杂蛋白洗涤目标蛋白洗脱 样品预处理:0.02MPBS(pH6.5)预处理样品液，离心取上清 柱的填装：调稀离子交换剂缓慢均匀连续倒入柱内 柱的平衡：用0.02MPBS(pH6.5)对柱进行洗脱，至基线平衡