DNA提取实验报告

1、生物学大实验（二）实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的 通过对智力扩增、 提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作， 加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。 经过处理的线状dna 在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒 dna 可以复性，从而可以实现质粒 dna 和染色体 dna 的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dn

2、a系列之内或其附近的特异位点上，并切割 dna。当对提取的质粒dna 进行电泳时，同一质粒 dna 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验步骤：一 质粒扩增（ 1 ）普通 lb 固体培养基制备：制备 lb 培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。（2）将大肠杆菌接种于lb 培养基中，37振荡培养过夜（200 转/ 分）二 质粒 dna 的提取 （ 碱法 ）1 将菌液倒入 1.5ml 的微量离心管中， 12000rpm 离心一分 30 秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；2 、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。3 、加入100“用冰预冷

3、的溶液i,剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。4 、加入200“ 现配的溶液ii ,盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴 510分钟。5 、加入150“预冷的溶液iii ,盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii 中，冰浴 5 分钟。6 、 取上部水相，移入新的离心管，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入 1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna,然后4C , 12000rpm离心10min。7 、 弃去上清液， 将离心管倒置于卫生纸上， 使离心管底部的液体流尽后， 加 入预冷的1ml

4、 70 乙醇。8 、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置 dna干燥510分钟。9 、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10 分钟或室温干燥。10 、将沉淀溶于34Wte缓冲液或灭菌水（ph8.0 ）中，储于-20 C冰箱中三 dna 酶切反应11 、 将洁净干燥并经灭菌的 eppendorf 管 （最好0.5ml ） 编号， 用微量移液枪分别加入dna （ u l ）和相应的限制性内切酶反应10X缓冲液2u l ,将管内溶液混匀后加入0.5 u l酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错

5、加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。12 、混匀反应体系后，将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37水浴锅保温2-3 小时，使酶切反应完全。13 、每管加入2u l0.1mol/l edta （ph8.0）,混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。四 dna 的琼脂糖凝胶电泳1 、 取5X tbe缓冲液100ml加蒸储水至1000ml,配成0.5 x tbe稀释缓冲液，待用。2 、 胶液的制备：称取 3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入 300ml 0.5 xtbe稀释缓 冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1

6、%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。3 、胶版的制备：想冷却至50-60 C的琼脂糖胶液中加入澳化乙锭（ eb）溶液使其终浓度为0.5 u lg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5 u Xtbe 稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面4 、加样：取200 l的酶解液与2 u 110 X载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip 头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品

7、槽底部的凝胶刺穿5 、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v ，电流在40ma以上，当澳酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳6 、观察和拍照五 实验结果六 实验结论通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好， rna 被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒 dna 跟 rna 同时存在，出现了两条亮带，质粒dna 跟 rna 分离效果较好。本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：（ 1 ） 取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且 要

8、垂直拔出；（ 2 ）点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；（ 3 ）电泳时，电极一定要连接正确（ 4 ）染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使用后废液不可不可随意丢弃。生物科学 071 班 姓名：刘欢学号： 20073305 篇二： dna 的提取和电泳实验报告基因组 dna 的提取和电泳（实验五）实验报告一、实验目的了解 dna 提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析dna 技术。二、器材和试剂1. 器材水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等2. 试剂1. 1mol/l tris.cl（ph8.0） 的配制：称取12.11

9、g 的 tris ，置于 80 ml 的 ddh20, 加入浓盐酸（约 4.2 ml ） , 调节 ph 值至 8.0 ，定容至 100 ml 。2. 0.5 mol/1 edta（ph8.0）的配制：18.61g na2edta 2h2o ,加入 80 ml 的 ddh2o,用naoh 颗粒调 ph 值至 8.0 （约需 2 g ） ，定容至 100 ml 。3. 提取缓冲液的配制： 100 mmol/l tris.cl（ph8.0）, 20 mmol/ledta, 500 mmol/l nacl,1.5%sds4. 80/4/16 氯仿：异戊醇：乙醇5. 6?loading buffer

10、： 0.15 溴酚蓝， 0.15 二甲苯青ff ， 5 mmol/l edta ， 50甘油三、实验步骤1. 在 15ml 的离心管中加入 5ml 的提取缓冲液，60水浴预热。2. 植物叶 1-2g ，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状，60 水浴保温20 min ，其间不时缓慢摇动。3. 5000 rpm 离心 5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，4. 加入 5 ml 氯仿 /戊醇 / 乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤） ，室温下静 置5-10 分钟，使水相和有机相混匀。5. 室温下离心5000 rpm 离心 5 分钟。6. 仔细吸取上清液至另一离心管中，

11、 加入一倍体积异丙醇， 混匀， 室温下放置片刻即出 现絮状沉淀。7. 离心 5000 rpm ，离心 5 min ，弃去异丙醇，室温晾干。8. 视沉淀多少，加入 1ml 左右 ddh2o 溶解，可在60水浴中放置15分钟以上助溶。9. 取dna样品5 l ,加入1科l6?loading buffer ,混匀，加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔中，电泳，检测 dna 的分子大小。4 、实验结果和讨论实验分析：本次实验由于种种原因我是和植保102 班的同学一起做的，我们组 3 人，实验过程比较严谨，受到了老师的表扬，实验结果也很令人满意。下面是实验过程中的注意点： 1 、研磨不能太久太用力，会导致dn

12、a 片段断掉。 2、实验室的某些试剂，如氯仿，有毒性，应带手套进行。电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错， 结果相差不是很远 （如上图） ， 第五组和第六组是我们的， 第六组是我自己加的。 实验过程中要耐心细心， 这样才能得到满意的结果。园艺 101石颖20100107011 篇三：浙大生化实验报告dna 的提取实验报告课程名称： 生化实验甲 指导老师： 成绩： 实验名称：植物基因组dna 的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤

13、（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、 讨论、 心得 一、 实验目的和要求1 、 学习并掌握植物基因组 dna 的提取原理和方法； 2 、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3 、学习并掌握对电泳检测基因组 dna 结果的初步分析； 4 、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5 、学习并掌握紫外吸收法测定基因组 dna 纯度与含量的方法。 二、实验基本原理植物基因组 dna 的提取方法就其提取原理主要有二种： 十六烷基三乙基溴化铵（ ctab） 法、 十二烷基硫酸钠 （sds） 法。 十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋

14、白，使核蛋白解聚，从而使dna 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（dna 、 rna） 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入无水乙醇使dna 沉淀， 沉淀 dna 溶于 te 溶液中，即得植物基因组dna 溶液。由于植物中的次生代谢产物多酚类化合物可介导 dna 降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna 聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的 ctab-dna 提取法步骤多，较烦琐， dna 产率低，而且由于酚很难完全去除， 容易影响以后的酶切等工作的效率。

15、 sds 法操作简单， 温和 , 也可提取到较高分子量dna，但所得产物含糖类杂质较多 , 这将直接影响dna 的限制性核酸内切酶酶切效果。 由于植物细胞匀浆含有多种酶类（ 尤其是氧化酶类） 对 dna 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂 （ 如巯基乙醇） 以降低这些酶类的活性。本实验采用十二烷基硫酸钠 （sds） 法提取植物基因组dna ， 基因组 dna 提取后， 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度；用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。dna 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 :dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。 dna 分子在高于等电点的溶

16、液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下， dna 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的 dna 片段泳动速度不同。 dna 片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料澳化乙锭（eb）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定 dna片断在凝胶中 的位置。紫外吸收法测定基因组 dna 纯度与含量核酸 dna 和 rna 所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。波长为 260nm 时， dna 或 rna 的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。

17、对标准样品来说，浓度为1g / ml时，dna钠盐的od260=0.02。当od260 = 1时，双链dna含量名勺为50科g / ml单链dna含量名勺为37g / mlrna含量名勺为 40科g / ml寡核甘酸含量约为30 dg / ml（由于底物不同有差异）1 、核酸样品dna 、 rna 含量的测定：如用1cm光径石英比色皿，用h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照，根据此时读出的 od260 值即可计算出样品稀释前dna 的含量：dna （科g/科l ） =50x od260读数x dna样品稀释倍数/1000rna （科g/科l ） =40Xod260读数x rna

18、样品稀释倍数/1000若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。当 dna 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响dna 吸光度的准确测定。由于dna在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， 盐和小分子则集 中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230,计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2 、核酸样品纯度判断的一般标准：dna纯度：od260/od280 1.8 ,表示为纯的 dna;od260/od280>1.9,表示有 rna 污染；od260/

19、od280<1.6,表示有蛋白质、酚等污染。 rna 纯度：1.7 v od260/od280 v 2.0 ,表示为纯的 rna;od260/od280<1.7时，表示有蛋白质或酚污染；od260/od280>2.0时，表示可能有异硫鼠酸残存。 od230/od260 的比值应在 0.4-0.5 之间， 若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和 pcr 的效果。三、实验材料与试剂1 、实验材料：植物幼嫩叶子2 、实验试剂（1） 1 ）基因组 dna 提取缓冲液（2） 2 ）

20、氯仿: 异戊醇 : 乙醇抽提液（3） 3 ） te 缓冲液（4） 4 ）平衡酚：（5） 5） rna 酶 a（6） 6 ）酚 / 氯仿（7） 7）氯仿/ 异戊醇（8） 8 ）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。（9） 9 ） 3mol/l naac（10） 5Xtbe缓冲液（11） 6 X电泳上样缓冲液（12） 1.0%琼脂糖凝胶（13） 13 ） eb（14） dna 分子量 markers ： 125， 564， 2027， 2322 ， 4361， 6557， 9416， 23130bp.（15） ddh2o ；四、实验器材与仪器1 、研体2 、离心机、离心管（7ml、5ml）及离心管架；3

21、、微量移液器10ul 、 200ul 、 1000ul 及枪头；4 、恒温水浴箱65 5 、制冰机；6 、冰箱；7 、恒温水浴箱37 ；8 、微波炉；9 、电泳仪及电泳槽；10 、紫外检测仪。11 、紫外分光光度计；12 、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组 dna1 、制胶（ 1琼脂糖凝胶） （此步骤由实验室老师准备）在胶模上架好梳子。称取 01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，力口 100ml 0.5 xtbe电泳缓 冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖， 待其冷却至5060 c后，加入eb,使其终浓度为0.5mg/l

22、 , 摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5 xtbe （刚好淹过胶面） ，拔去梳子备用。 （注： eb 为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2 、加样取5ul纯化的dna原溶液样品，与1ul 6 x电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡） 。若 dna 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3 、电泳加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到 100v ，恒压电泳。当溴酚蓝条带 移动到

23、距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需 3060min）。4 、观察和拍照取出胶块置于紫外灯下观察， dna 存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。 （注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察） 。 紫外吸收法测定基因组 dna 纯度与含量将提取的植物基因组 dna 样品吸取 20ul ， 加到新的 5ml 离心管中， 再加一定量的 ddh2o 或 te 缓冲液（ ph 8.0）稀释 100 倍，用 0.5cm 光径石英比色皿（约需1.6ml 样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nms 260nms 280nm处的吸

24、光度。计算植物基因组dna样品溶液的 dna 的含量以及dna 样品的纯度。六、结果与分析（一）这是电泳后得到的照片，其中从右往左数第七条带为我所做样品的基因组。（二）紫外吸收法测定基因组 dna 纯度与含量1 、植物基因组dna 样品溶液的dna 的含量：dna （g/l ） =959.328ng/ul2 、植物基因组dna 样品溶液的dna 的纯度：od260/od280= 1.97od230/od260= 2.073 、样品纯度判断：od260/od280 弋1.8 ,表示为纯的 dna； od260/od280>1.9,表示有 rna 污染；od260/od280<1.6,

25、表示有蛋白质、酚等污染。由od260/od280 = 1.97可知，样品含有 rna杂质。七、讨论、心得注意事项：影响dna 泳动速率（迁移率）的因素有： dna 分子质量的影响： 双链 dna 分子迁移的速率与 dna 分子量对数成反比。 分 子 量越大，迁移率越小。dna构型的影响：超螺旋 dna>线状dna>开环dna 胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1%2%; 电场强度的影响： 电场强度愈大， 带点颗粒的泳动越快。 但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压， （一般 5v/cm ） （电场强度） 。而对于大片段电泳，

26、甚至用0.51.0v/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。eb的影响：澳化乙锭（eb）插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 电泳缓冲液的影响: 核酸电泳常采用 tae 、 tbe 、 tpe 三种缓冲系统， 但它们各有利弊。tae 价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 tpe 在进行 dna 回收时，会使 dna 污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 tbe 缓冲液。在缓冲液中加入 edta ，可以鳌合 二价离子，抑制dnase ,保护dna。缓冲液ph常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正 极移动。 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大在 d

27、na 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（ 1 ） dna 的二级结构和双链易受多种因素 （如强酸、 强碱、 加热、 低盐浓度、 有机溶剂、 酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性” ，因此抽提时避免使用变性的条件。（ 2 ）抑制内外源dnase 的活力。 dnase 就象一把刀，它能把大分子的 dna 切成碎片，所以要加以杜绝， 现可以通过多种途径来做到这一点：a、 低温操作； b、 调节 ph ， 使偏碱 （ ph8.0 ） ；c 、 抽提液中加表面活性剂；d、 加螯合剂 （ edta ） 除去酶的铺助因子（ mg2+） ， 使酶活性丧失。（ 3 ）防止化学降解。如过酸或过碱以

28、及其它化学因素，会使dna 降解，一般综合考虑，取 ph8.0 左右为宜。（ 4 ）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等， dna 分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使dna 断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（ 5 ） 植物的次生代谢物 （主要是胞质内的多酚类或色素类化合物） 对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取dna 的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少， dna 含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。由结果可知， 在加入 rna 酶的时候可适当

29、多加一点， 以免造成得到的 dna 样品含较多 rna 杂质。篇四： dna 提取实验报告注： 1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。2 、学生提交实验报告时间为实验后10 日内。篇五： dna 提取及 pcr 扩增实验报告pcr 扩增及 dna 琼脂糖凝胶电泳刘琳 1131428 环境科学一、实验目的1 学习并掌握pcr 扩增的基本原理与实验技术。2 对扩增后的dna 进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理1. pcr 扩增多聚酶链反应（ pcr ） 技术的原理类似于 dna 的天然复制过程。 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板dna、四种脱氧核甘酸

30、（dntp ）、耐热taq聚合酶及两个合成dna的引物，而后加热使模板dna 在高温下（ 94 ）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55）与模板dna 互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72），在 tap 酶作用下，用四种 dntp 为原料，引物为复制起点，模板 dna 的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和dna 合成这一循环，使产物 dna 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物 dna 可作为后一循环的模板dna 而参与 dna 的合成，使产物 dna的量按

31、指数方式扩增。经过3040个循环，dna扩增即可完成。2. dna 琼脂糖凝胶电泳实验dna 分子在高于其等电点的溶液中带负电， 在电场中向阳极移动。 在一定的电场强度下，dna 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。 dna 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 dna 分子的迁移速度不同。该电泳方法 以琼脂凝胶作为支持物，利用 dna 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物 的目的。三、实验材料仪器： pcr 扩增仪、 0.2ul 薄壁管、 1.5ml 离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水 平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂：ta

32、pdna聚合酶、dntp、buffer、两种引物、16s全长dna样本、无菌ddh2o、模 板 dna 、 tbe 、琼脂糖、 eb 、显色剂。四、 实验步骤1. pcr 扩增本次试验选择细菌 16s rdna v3 区片段进行扩增。1.1 根据计算，首先取 1.5ml 离心管按照 2.5ul 10 x buffer 、1 ul dntp、0.5 ul 341gc、0.5 ul 534 、 0.125 ul taq 、 19.375u ddh2o 的比例配置足量的 pcr 反应体系。1.2 分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加8 种不同的模版，并于第 9 个薄壁管

33、中加入无菌ddh2o 作为阴性对照。1.3 将薄壁管放入 pcr 扩增仪中，按照预定程序进行pcr 扩增。其中循环过程需要达到3040 次。程序如下：预变性： 94 3min循环： 94 变性 30s55退火30s72延伸30s末次延伸：72 5min1.4 pcr 扩增完成后，将样品取出并保存于15环境中。2. dna 琼脂糖凝胶电泳实验2.1 称取0.2g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5Xtbe电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60 左右，在胶液内加入适量的eb。2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60左右的胶液，使之形

34、成均匀水平的胶面。2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。2.4 在槽内加入0.5Xtbe电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1小 缓冲?和51待测dna 样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。2.5 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过 5v/cm ，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。2.6 观察澳酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。五、实验结果与讨论如图所示：

35、从左至右，分别是模版1-8 号，第 9 列为阴性对照。前 8 列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在 200bp 左右。在第9 个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker对比可知该片段出现在100bp左右，并非由于实验操作等问题而产生的污染。实验的照片显示实验结果有拖尾现象，但是并不影响后续实验。在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，并没有完全加入，可能会出现一些误差。另外在第1 列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为