实验一、 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内

1、实验一、 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化本实验应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，取切割后1、3、7、14、21和28d海马组织和正常海马组织，制备提取液，然后应用半定量RT-PCR技术检测Brn-4 mRNA的表达，与正常海马组织比较，观察切割后各时相点海马组织中Brn-4 mRNA的表达变化。材料和方法1 实验材料1.1实验动物：健康成年SD大鼠，体重220250g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。1.2试剂及溶液的配制：（1） Trizol Reagent（BBI公司）（2） DEPC（SIGMA公司）（3） 逆转录试剂盒（MBI公司）

2、（4） Taq DNA polymerase（MBI公司）（5） dNTP mix（MBI公司）（6） DL-2000 DNA Maker（TAKARA公司）（7） 琼脂糖（Pharmacia公司）（8） 溴化乙锭(SIGMA公司)（9） Chlorpent复合麻醉剂：水合氯醛4.25g，MgSO4 2.12g，戊巴比妥钠886mg，无水乙醇14.25ml，丙二醇33.8ml，加ddH2O至100ml。（10）DEPC水：1000 ml双蒸水中加入DEPC 1ml，充分振荡，37孵育过夜，高压灭菌20 min，4保存备用。（11） 5TBE：Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA 4.65

3、g，加ddH2O至1000ml。使用时1:10稀释为0.5TBE工作液。（12）6上样缓冲液：溴酚蓝0.25g溶于30%甘油100ml，分装小管，4储存。（13）琼脂糖凝胶：根据待测DNA分子大小，选择适当浓度的琼脂糖浓度，用0.5TBE缓冲液配置。（14）EB染液(10mg/ml)：溴化乙锭1.0g，加ddH2O至100ml，4避光保存。（15）5甲醛凝胶电泳缓冲液：取20.6g丙磺酸溶于800ml DEPC处理的50mmol/L的乙酸钠溶液中，用氢氧化钠调pH至7.0，加10ml DEPC处理的0.5mol/L EDTA（pH8.0），最后加DEPC处理水至溶液总体积为1L。（16）甲醛凝

4、胶上样缓冲液：甲酰胺0.75ml，甲醛0.24ml，5甲醛凝胶加样缓冲液0.3ml，甘油0.15ml，溴酚蓝0.05ml，置-20保存。1.3实验仪器：（1） 恒温水浴锅 (上海华联环境试验设备公司)（2） 低温冷冻离心机 (德国Beckman公司)（3） PCR仪 (MJ Research公司)（4） DYY10型（ECP3000）三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）（5） 捷达801系列形态学分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）（6） 蛋白核酸测定仪（Eppendorf公司）（7） 立体定位仪（上海江湾型C）2 实验方法2.1实验动物分组取SD大鼠42只，随机分成7组，设其中1组为正常对照组，

5、其余6组分别为穹窿海马伞切割手术后1、3、7、14、21和28d组，每组6只。2.2切割双侧穹窿海马伞取220250g SD大鼠，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 0.2ml/100g。动物麻醉后，固定于立体定位仪上，颅顶部剪毛，碘酒和酒精消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）的坐标，参照Paxinos图谱确定双侧穹窿海马伞的切割范围，先在颅骨上确定右侧两点即A1=A1.4、L1L1和A2A1.4、L2L4；左侧两点即A3=A1.4 、L3L1和A4A1.4、L4L4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧和、左侧和点间颅骨划开一条骨缝

6、，将针刀插入脑内至切割深度即V12,34V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，按性别分笼饲养。2.3海马总RNA的提取（1） 将正常组及手术后各组大鼠用Chlorpent复合麻醉剂腹腔注射麻醉，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体，暴露两侧海马，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两侧海马组织（约50mg/只）。（2） 将取出的海马置2ml匀浆器中，加入1ml Trizol试剂，置冰上充分匀浆，室温置5min，转入1.5ml离心管；（3） 加入200l氯仿，剧烈震荡混匀30sec；（4） 室温12000rpm离心5min；（5） 转移

7、上清到1.5ml离心管中，加入500l异丙醇，室温放置5min；（6） 室温12000rpm离心5min，小心移去上清；（7） 加700l 70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心2min，弃上清。（8） 室温干燥使乙醇完全挥发，沉淀用50l DEPC水溶解（65促溶15min）。2.4总RNA含量分析取总RNA 1l加入到99l DEPC水中稀释，用蛋白核酸测定仪检测浓度及OD260/OD280值，计算总RNA浓度，并鉴定RNA的纯度。2.5 RNA甲醛变性凝胶电泳（1） 甲醛变性凝胶的配置：适量琼脂糖溶于1甲醛电泳缓冲液（pH6.97.0），至终浓度1。微波炉溶解琼脂糖，然后冷却至5060

8、。将37甲醛溶液（12.33mol/L）加入凝胶溶液，至终浓度0.32mol/L，加2l EB染液，混匀倒入制胶盘中（制胶盘约30ml），插好梳子，待凝胶凝固1h。（2） 在EP管中，将RNA样品与上样缓冲液混合。70水浴变性15min，立即冰浴10min，使RNA变性，1200rpm离心5sec，使液体全部沉积在EP管底。（3） 将凝胶浸入1甲醛凝胶电泳缓冲液中，加样前将凝胶预电泳5min。（4） 将样品加至凝胶加样孔，5V/cm电压下进行电泳2h。（5） 在紫外透射仪中进行检测，将合格的RNA样品挑选出来。2.6 第一链cDNA的合成（1） 取0.5ml EP管置于冰上，加入下列反应物：总

9、RNA2lOligo dT(0.5g/l)1lDEPC水加至12l（2） 轻轻混匀，离心35sec。（3） 70加热5min立即将EP管插入冰中30sec，短暂离心收集液滴。（4） 将EP管置于冰上，依次加入：5reaction buffer4lRNase inhibitor(20U/l)1ldNTP mix(10mmol/L)2l（5） 轻轻混匀，稍加离心。（6） 37孵育5min，加入M-MLV逆转录酶(200U/l) 1l。（7） 42水浴，孵育60min。（8） 70加热10min以终止反应，分装，20保存备用。2.7引物设计 根据GenBank登录的大鼠Brn-4和GAPDH基因序列

10、，通过Primer5软件分别设计Brn-4和GAPDH的引物，经GenBank BLAST同源性检索后，由上海生工生物技术工程有限公司合成。Brn-4引物序列如下：LEFT PRIMER： 5-GGGTGACCAGTCTTAGCGAC-3 170189位点；RIGHT PRIMER：5 -GCGAGTACACATTGAGGGGT-3 406387位点；预计扩增片段长度237bp。GAPDH引物序列如下：LEFT PRIMER： 5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 550569位点；RIGHT PRIMER：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 1001982位点；预计

11、扩增片段长度452bp。2.8 PCR（50l体系）（1） 取0.2ml EP管，依次加入：第一链cDNA模板2l上游引物2l下游引物2l10buffer5lMgCl2(25mmol/L)5ldNTP mix(2mmol/L)5lTaq酶(2U/l)1lddH2O 28l（2） 将上述混合物轻轻混匀，稍加离心。（3） 在PCR仪上进行扩增，程序如下：94 3min（94 40s，54 30s，72 40s）循环30次72 10min（4） 在10个循环结束后加入GAPDH上下游引物各1l，继续循环。（5） 电泳检测PCR扩增结果。2.9 DNA琼脂糖凝胶电泳（1） 称取适量琼脂糖粉末，放入锥形

12、瓶中，加入适量0.5TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，摇匀。冷却至60左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5g/ml。（2） 水平放置胶模，在一端插好梳子，在模内缓慢倒入冷却至60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。待胶凝固，小心拔起梳子。（3） 将凝胶放入电泳槽，使加样孔端位于阴极端。加入0.5TBE电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面12mm。（4） 取待检测PCR样品10l，与2l 6上样缓冲液混匀，用移液器加至凝胶的加样孔中。（5） 接通电源，调节稳压输出，电压5V/cm，开始电泳。（6） 电泳完成后切断电源，取出凝胶，置凝胶于紫外灯下观察结果。（7） 用捷达图像分析系统

13、对凝胶各泳道中的GAPDH和Brn-4条带进行光密度扫描。2.10统计学分析：以各泳道中Brn-4与GAPDH条带的光密度比值表示Brn-4 mRNA的相对表达量，建立相对表达量密度积分柱形图。数据输入Stata7.0统计软件，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用q检验(SNK法)。结 果1 RNA检测：经蛋白核酸测定仪检测，所提取的总RNA的OD260/OD280值在1.82.0之间，说明RNA纯度较高。RNA甲醛变性凝胶电泳结果显示28S和18S条带清晰，5S条带呈淡云雾状，28S RNA : 18S RNA约为2 : 1，表明RNA样品无降解。结果见图1。28S18S5S图

14、 1 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis of RNA2 半定量RT-PCR分析：2.1 琼脂糖凝胶电泳检测：Brn-4GAPDH100bp250bp500bpM1234C56RT-PCR扩增Brn-4基因(237bp)和内参GAPDH基因(452bp)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，以PCR Marker为标准，在237bp和452bp处分别呈现清晰条带。结果如图2所示。图 1 各组Brn-4和GAPDH的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel elect

15、rophoresis analysis showing the RT-PCR products of Brn-4 and GAPDH of different group M：DNA分子量标准品（DL2000）C：正常对照1：切割后1d 2：切割后3d3：切割后7d 4：切割后14d5：切割后21d 6：切割后28d2.2 切割穹窿海马伞对Brn-4 mRNA表达的影响：穹窿海马伞切割后Brn-4 mRNA的相对表达量变化结果详见表1，不同时间点Brn-4 mRNA相对表达量密度积分柱形图如图3所示。方差分析和均数两两比较（表2）表明，切割后1d、28d组与正常对照组相比，Brn-4 mRNA

16、的相对表达量差异无显著性意义(P0.05)，3d、7d、14d和21d组与正常对照组相比，差异均有显著性意义(P0.05)，其余各组间的表达差异均有显著性意义(P0.05)。说明Brn-4 mRNA表达量自切割后第3d开始明显升高，14d时达到最高水平，以后开始下降，于28d左右恢复至正常水平。表1 正常对照组和切割各组Brn-4 mRNA相对表达量Table.1 The relative level of Brn-4 mRNA expression of normal control and transection groups组别Brn-4 mRNA表达量(Brn-4/GAPDH)正常组

17、0.1380.0601d组 0.1430.0323d组 0.2560.5407d组 0.5400.07214d组0.7190.12421d组 0.5070.08828d组 0.1890.059表2 正常对照组和切割各组Brn-4 mRNA相对表达量的组间差异 (两均数之差/ P值)Table.2 The multiple comparison of Brn-4 mRNA relative expression level among normal control and transection groups组别正常组1d组3d组7d组14d组21d组1d组.00550.9873d组.11850.011.1130.0177d组.40180.000.396