高效液相法文献讲解

1、高效液相色谱法测定栀子苷的含量药物分析药物分析核农学报核农学报 2008,22(5):669673Journal ofNuclearAgricultural Sciences作者：胡晓丹作者：胡晓丹 张德权张德权 田田 许许 牛牛 渊渊目录 1. 研究内容 1.1 栀子苷理化性质 2. 栀子苷提取工艺 2.1 栀子苷的提取方法 2.2 栀子苷最大波长确定 3. 考察影响栀子苷测定的因素 3.1色谱分析的选择 3.2流动相的选择 4. 方法学评价 4.1 精密度及重现性试验 4.2 稳定性试验 4.3 加样回收试验栀子苷栀子苷（ Geniposide ）：）：栀子苷是从茜草科植物栀子的干燥成熟果

2、实中运用高科技生产工艺提取精制而成的产品。栀子苷为环烯醚萜苷类化合物，异名京尼平苷，都梅子素葡萄糖苷去羟栀子苷。栀子苷有多种用途，不同条件的发酵，可以制成天然食用着色剂栀子蓝和栀子红，也是用于治疗心脑血管、肝胆等疾病及糖尿病的原料药物。栀子苷的重要性质：栀子苷的重要性质： 溶解性：易溶于水，溶于乙醇，不溶于石油醚检测波长：240nm性状：环烯醚萜苷类化合物，对-萘酚、羟肟酸、三氯化铁呈正反应。白色、类白色或浅黄色结晶。分子式：C17H24O11 课题材料及来源：课题材料及来源：材料：材料： 栀子：购于北京同仁堂药店,产地江西 栀子苷对照品:来自中国药品生物制品检定所(批号110749-2005

3、12) （ 注：甲醇为色谱纯,水为超纯水）仪器：仪器： LC-20A型高效液相色谱仪 ShimpackHRC-ODS分析柱：4.6mm250mm,5m SPD-M20AV型二极管阵列检测器 LCsolution液相工作站：岛津公司产品 KQ-250D型超声波仪：昆山市超声波仪器有限公司产品,频率50Hz,总功率250W。提取实验：提取实验： 取栀子样品粉碎过20目筛,称取1g,精确至0.0001g,置于50ml容量瓶中,加入甲醇-水(11,V/V)25ml,然后分别采用索氏提取、水浴加热回流和超声波提取三种前处理方法对栀子苷进行提取。索氏提取和水浴加热回流法均采用80提取1h,超声波提取法采用

4、250W功率,室温下分别提取0.5、1.0、1.5和2.0h,比较确定三种方法对栀子苷的提取效果。 获得栀子苷提取液,用甲醇-水(11,V/V)定容至50ml,离心30min(3500r min),取上清液过0.45m微孔滤膜,取滤液1ml,用甲醇-水(11,V/V)定容至25ml,备用。样品前处理方法选择：样品前处理方法选择： 栀子苷的提取方法文献报道较多,但都比较麻烦、费时、费溶剂。本试验选用甲醇-水(1 1,V/V)混合液作为提取溶剂,比较了索氏提取法、水浴加热回流法和超声波提取法(时间均为1h)提取栀子中栀子苷的效果,并对超声波提取时间对提取效果的影响进行了研究,结果(表4和表5)表明

5、,超声波提取法提取效果最好,而且操作方便、简单、易行,提取1.0h即可达到栀子苷99.89%提取率。标准溶液配制：标准溶液配制：称取栀子苷对照品1.2mg,精确至0.01mg,置于50ml容量瓶中,用甲醇-水(11,V/V)定容,配成栀子苷含量为24g ml的贮备液。取一定量的贮备液,用甲醇-水(11,V/V)稀释成浓度为2、4、8和16g ml的标准溶液,备用。最佳检测波长的确定：最佳检测波长的确定：取栀子苷标准液进样,二极管阵列检测器在波长190450nm范围内进行光谱扫描。最佳检测波长结果：最佳检测波长结果：结果如图1所示,其最大紫外吸收波长分别为195nm和240nm,但在195nm处

6、流动相甲醇也有一定吸收,检测容易受到干扰,为减少流动相对检测的干扰,试验确定检测波长为240nm。色谱分析条件选择：色谱分析条件选择：试验采用ShimpackHRC-ODS分析柱(4.6mm250mm,5m),柱温25 ,以甲醇-水为流动相,比较不同配比甲醇-水对栀子苷的分离效果,并对流动相流速进行选择;通过对栀子苷标准液光谱扫描确定最佳检测波长。流动相的选择：流动相的选择：文献分析与试验比较最终选用甲醇-水作流动相,并对其配比和流速进行了研究,结果表明,甲醇-水配比为3070(V/V)、流速为1ml/min时,对照品中栀子苷的保留时间为15.057min,栀子样品中的栀子苷与其他成分分离效果

7、较好。如图：精密度与重复性试验精密度与重复性试验：准确吸取5l标准溶液,在建立的色谱分析条件下重复进样5次,分析测定栀子苷的含量,并记录保留时间,进行统计分析,结果见表1,保留时间及栀子苷含量的相对标准差均在5%以下,表明本试验具有良好的重现性,色谱条件合理。稳定性试验稳定性试验：分别准确吸取5l栀子苷标准液和栀子样品液,在建立的最佳色谱分析条件下每1h进样1次,共5次,分析测定栀子苷含量。结果(表2)表明,标准液与样品液中栀子苷含量的相对标准差均在5%以下,表明栀子苷在5h内测定结果稳定。回收率试验回收率试验： 准确称取栀子样品200mg(栀子苷含量为3.68g 100g),精确至0.01m

8、g,研细,准确加入栀子苷对照品1.56mg,按样品液制备方法制备测试液,准确吸取测试液5l,在建立的最佳色谱分析条件下进样5次,重复测定测试液中栀子苷的含量,去除来自栀子中的栀子苷含量,计算栀子苷对照品的加样回收率。结果(表3)表明,栀子苷加样回收率达到了98%以上,相对标准差在5%以下,说明试验建立的栀子苷高效液相色谱检测方法切实可行。不同样品中栀子苷的含量项目项目栀子中栀子苷的含量栀子中栀子苷的含量（g/100g）栀子黄色素中栀子苷的含栀子黄色素中栀子苷的含量（量（g/100g）测定平均值 3.676 0.257标准差(SD)0.10.011相对标准差(RSD,%)2.724.28结论结论: :本试验采用超声波法提取技术和反相高效液相色谱-二极管阵列检测器分析技术