广西大学 高级生物化学课件— 重组DNA技术-2

1、重组重组DNA技术技术第一节第一节 概述概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复结合成一具有自我复制能力的制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化或转复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（克隆又称基因克隆（gene cloning）。）。 基因工程（基因工程（genetic engineering）：实

2、现基因克）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技技术（术（recombinant DNA technology）一、一、克隆体系：目的基因、载体克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿工具酶、宿主细胞等主细胞等 1、目的基因目的基因（target gene）：cDNA或基因组或基因组DNA 2、载体载体(vector)：质粒质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录：指体外经反转录合成的，与合成的，与RNA （常指（常指mRNA）

3、互补的单链）互补的单链DNA,单链单链cDNA进而合成双链进而合成双链cDNA。基因组基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组序列，称为基因组DNA。质粒质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环：存在于细菌染色体外的小型环状双链状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在存在于细菌体内，能够

4、识别和切割双链于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。苷酸序列的一类核酸酶。 3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、酶、DNA酶，等酶，等 常用的是常用的是IIII类限制性内切酶类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶许多限制性核酸内切酶IIII的识别序列属于回文结构的识别序列属于回文结构配伍末端（配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端生的相同粘性末端 3.2 DNA聚

5、合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、（全酶）、Klenow片段片段 (Klenow 酶酶)、T4 DNA聚合酶以及聚合酶以及Taq酶等酶等 3.3 DNA连接酶连接酶T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞 DH5, JM109 (RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1, (lac-proAB)/F traD36, lacIq, lacZ M15) M15 INVSc1(MATa his31 leu2 trp1-289 ura3

6、-52/MAT his31 leu2 trp1-289 ura3-52), Phenotype: His-, Leu-, Trp-, Ura-第二节第二节 DNA克隆的基本过程克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达分、切、接、转、筛、表达一、一、“分分”：目的基因及载体的制备：目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法：化学合成、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、基因组文库、cDNA文库文库 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反应体系中加入模板在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特、特别设计的特异引物及耐热的

7、异引物及耐热的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），经多次酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合呈指数合成的过程成的过程 cDNA文库文库(cDNA library)：以：以mRNA为模板，利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA，再复制成双链，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有体菌包含了所有cDNA信息，总称信息，总称cDNA文库文库 。常用常用于筛选编码蛋白质的结构基因。于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组基因组DNA文库文库(

8、genomic DNA library)：利用限制：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组有基因组DNA信息，总称基因组信息，总称基因组DNA文库文库 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA 克隆载体（克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等扩增、序列分析和体外定点突变等 pUC19, pK18mob表达载体表达载体(expression

9、vector)：用于在宿主细胞中表达：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物外源目的基因，获得大量表达产物 pQE30, pYES2二、二、“切切”：限制性内切酶切割目的基因和载体：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA 三、三、“接接”：重组体的构建：重组体的构建 四、四、“转转”：重组：重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 1、转化（、转化（transformation）：将质粒或其它外源）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞(常用大肠杆菌常用大肠杆菌)，并使其获得新的，并使其获得新的表型的过程表型的过程 2、转染（、转染（transfection）：将外源）：

10、将外源DNA导入真核细胞导入真核细胞的过程的过程 3、感染（、感染（transfection）：以）：以l l噬菌体、柯斯质粒和噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction） 五、五、“筛筛”：筛选出含重组：筛选出含重组DNA的受体细胞的受体细胞 1、直接选择法：遗传标记、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标

11、记（养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂、分子杂交）交）】 2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法 六、六、“表达表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达达 1、外源基因在原核细胞的表达、外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体性的包涵体 2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等 插入突变（转座子）整合突变（自杀质粒

12、）缺失突变点 突 变定点突变随机突变：插入突变插入突变细菌转座子：插入序列 （Insertion sequences） 复合转座子（Composite transposons） TnA转座子家族（TnA famlily） 可转移噬菌体（ Mu phage） Tn5gusA5EZ-Tn5Distribution of Tn5gusA5 in the genome（partial）ORF2ORF2gusAIS50RKanORF1ORF3Predicted size of PCR productUPDPIS50R SPM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

13、17 18 19 20 21 22 23 24 gusA SPPredicted size of PCR productM : DNA marker (100bp)；124: PCR products Physical map of pK18mobNonpolar gene inactivation by single site integration of a homologous plasmidPlacKanlacZTarget ORFpK18mobchromosomePlacKanlacZPartial seq of ORFchromosomemutantPlacKanlacZDowns

14、tream ORF SPPCRGel analysisMutant comfirmationPfu Amplification of truncated fragments of target ORF Digestion of pK18mob with Sma IT4 DNA LigaseElectro-transformationScreening and confirmationTri-parents conjugationScreening and confirmationMutants preservationATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GG

15、G GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TT平连平连 ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC3n(3n+2)酶连酶连 ATG ATT ACG AAT TC3n+1(3n+2)5端端sacB gene Bacillus subtilis (枯草杆菌) sacB gene that encodes levansucrase (蔗糖-6-果糖基转移酶) is aparticularly useful tool since it provides a positive selection for the recombi

16、nation event. Encoding levansucrase (Lepesant et al., 1974), its expression is inhibitory to the growth of many Gram-negative and gram-positive bacteria in the presence of sucrose (Gay et al., 1985; Ried and Collmer, 1987; Kaniga et al., 1991; Jager et al.,1995; Pelicic et al., 1996)ABCDpK18mobSacB整

17、合整合1st整合整合2nd整合整合Left flankRight flankpT18mobGmLeft flankRight flank8004 genomeAmplified from pPH1JIKpn IBamH IXba IEcoR I缺失突变技术路线缺失突变技术路线Target ORF1、取旁侧序列 (1.5 kb）2、设计旁侧引物和Gm引物 (EcoR I, Kpn I, BamH I, Xba I, Pst I, Hind III)3、扩增旁侧和Gm片段 4、酶切载体、旁侧和Gm片段 5、四片段连接，转化，Tc,Gm,IPTG,X-Gal筛选6、以两外侧引物扩增验证和酶切验证7、

18、阳性克隆三亲导入Xcc 8004，Rif,Gm筛选8、筛选Tc敏感接合子9、PCR验证（8004、Tcr、Tcs）概述概述质粒载体质粒载体 质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体理想载体的条件：理想载体的条件： 1、具有自主复制能力；、具有自主复制能力； 2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体色体DNA分开；分开； 3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；、分子量相对较小，能够容纳目的基因； 4、具有较多单一限制性内切酶位点；、具有较多单一限制性内切酶位点； 5、有一个或多个筛选标记；、有一个或多个筛选标记； 6、具有较高的遗传稳定性。、具有较高的遗传稳定性。

19、质粒载体质粒载体1977年由Boliver等人自E.coli的天然质粒建成。1、克隆载体、克隆载体常用克隆载体常用克隆载体An example of an E. coli expression vector质粒载体质粒载体2、表达载体、表达载体常用表达载体常用表达载体E. coliYeast噬菌体载体噬菌体载体其它类型载体其它类型载体一、一、质粒（质粒（cosmid）二、逆转录病毒载体二、逆转录病毒载体三、三、Ti质粒质粒http:/www.dsmz.de/microorganisms/plasmid_info.php?dsmz_no=6305 pLAFR20352 bpEcoRI (1)Sa

20、lI (16146)SmaI (15018)SmaI (15784)SphI (1232)SphI (4356)SphI (10825)SphI (17478)pLAFR1, pLAFR3, pLAFRJ, pLAFR6 SacI KpnIDNA Seq. 2004 Jun;15(3):225-7.Genetic and physical map of the pLAFR1 vector.Vanbleu E, Marchal K, Vanderleyden J.Centre of Microbial and Plant Genetics, Katholieke Universiteit Leu

21、ven, Kasteelpark Arenberg 20, 3001 Heverlee, Belgium.AbstractThis paper presents the complete sequencing and annotation of the pLAFR1 vector. pLAFR is a tetracycline-resistant cosmid cloning vector, which is derived from the 20 kb plasmid pRK290, a RK2-derivative. Due to its broad host range, the pL

22、AFR1 vector has been widely used in the genetic analysis of a broad number of gram-negative bacterial species. The availability of the complete pLAFR1 sequence will most definitely help in the construction and analysis of clone librares based on pRK290 or pLAFR vectors.TCT AGA GGA TCC CCG GGT GGT CA

23、G TCC CTT ATGXba IBamH ISma IFrom Clontech catalogue 1996/97NOS-ProNPT II (Kan)NOS-ter CaMV 35S promoterXba I BamH ISma I-glucuronidaseNOS-terRBLBpBI121ATGTGAPstISph IHind IIIPst IPst ISph ISph IEcoR ITCT AGA GGA TCC CCG GGT GGT CAG TCC CTT ATGXba IBamH ISma IFrom Clontech catalogue 1996/97NOS-ProNP

24、T II (Kan)NOS-ter CaMV 35S promoterXba I5816BamH I5822Sma I5829-glucuronidaseNOS-terRBLBpBI121 14758 bpATG5845TGA7656PstISph IHind IIIPst IPst ISph ISph IEcoR I798377277979Sac I771628383632 25192825245424784022427749745808nptII: 2901-3629T-NOS: 4022-4277CaMV 35S: 4974-5808GUS: 5845-7656T-NOS: 7727-7

25、979RB: 8621-8646RB: 2454-2478 P-NOS: 2519-2825Kan: 2838-363286218646其它类型载体其它类型载体四、酵母人工染色体（四、酵母人工染色体（YAC）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence. The dimeric enzyme (with its two subunits in gray and light blue) i

26、s shown bound to DNA. In the top view the DNA binding site is facing the viewer. In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 工具酶工具酶 功功 能能 限制性内切酶限制性内切酶 识别特异序列、切割识别特异序列、切割DNADNA DNADNA连接酶连接酶 连接连接DNADNA片段片段 DNADNA

27、聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反转录酶反转录酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷酸化 末端转移酶末端转移酶 在在3 3 羟基末端进行多聚物加尾羟基末端进行多聚物加尾 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤1、分、分2、切、切3、接、接5、筛、筛4、转、转6、表达、表达基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获得OH 3 OH 3 OH 3

28、Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA templatecDNADNA polymerase IdNTPsAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTTnT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNA三、三、cDNA文库的

29、建立文库的建立四、DNA聚合酶链反应（PCR）目的基因的获得目的基因的获得聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反应体系中加入在反应体系中加入模板模板DNA、dNTP、特别设计的特异、特别设计的特异引物引物及耐热的及耐热的DNA聚合酶聚合酶（常用（常用Taq酶），经多次变性、酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程呈指数合成的过程 反应体系：反应体系： 1. 模板要求：模板要求：浓度偏高会引起错配浓度偏高会引起错配 2. dNTP及引物用量：及引物用量：引物浓度偏高会引起错配和非特引物

30、浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 3. Buffer：增加增加Mg2+浓度会降低聚合酶对模板的特异性，浓度会降低聚合酶对模板的特异性，稳定非互补的碱基对，引起错配稳定非互补的碱基对，引起错配 4. DNA聚合酶：聚合酶： 引物设计原则：引物设计原则：1. 长度：长度：21-25 bp2. Tm： 553. GC含量：含量： 40%4. 酶切位点酶切位点5. 参数：避免发夹结构参数：避免发夹结构6. Rating值：值：162 错配错配PCR 软件：软件：Vector NTI重组体构建重组体构建一、一、DNA片段片段A DNA片段片段B 5 3 5 A G A T C T3 3 5 3 T C T A G A5 不同的限制性内切酶水解不同的限制性内切酶水解混合后经混合后经DNA连接酶连接连接酶连接BamHI BglII G A T C T A G A T C TA 粘端粘端配伍末端连接配伍末端连接重组体构建重组体构建Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to