化学生物学第六章 化学物质与蛋白质相互作用

1、大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学第六章第六章 化学物质与蛋白质的相互作用化学物质与蛋白质的相互作用 Chapter 6. Interactions between chemicals and proteins 第八次课第八次课大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%以以上，种类繁多，在生命活动过程中发挥着各种各样的上，种类繁多，在生命活动过程中发挥着各种各样的作用。随着人们

2、对环境保护和生活质量要求的提高，作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。泛。 在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作专

3、一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。用以及化学修饰作用等。 第一节第一节 概概 述述 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学球状蛋白三级结构的主要特征球状蛋白三级结构的主要特征 绝大多数蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白绝大多数蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有内部的空间约有75被原子所充满。这样的密集程度被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与某些晶体相比。远远超过

4、在液体中的小分子，可以与某些晶体相比。 蛋白质可认为是带有极性外套的油滴，也就是蛋白质可认为是带有极性外套的油滴，也就是“非极非极性在内，极性在外性在内，极性在外”。大量蛋白质的。大量蛋白质的X射线晶体衍射射线晶体衍射分析统计结果充分证明了这一规律。分析统计结果充分证明了这一规律。 存在于蛋白质内部的主要是一些非极性残基侧链，约存在于蛋白质内部的主要是一些非极性残基侧链，约有有63是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸氨酸等；带电的残基，如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有和精氨酸只有4。约。约95的带电

5、侧链分布在蛋白质的带电侧链分布在蛋白质表面；约表面；约14的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。酸在蛋白质分子表面。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学蛋白质内部存在极少量的亲水残基，表面也常见到一些疏蛋白质内部存在极少量的亲水残基，表面也常见到一些疏水残基。这些水残基。这些“异常异常”分布的残基，致使肽链的局部结构分布的残基，致使肽链的局部结构发生发生“扭曲扭曲”，一些键的张角与一般正常的值有偏离，蛋，一些键的张角与一般正常的值有偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量

6、，相对处于较白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对处于较不稳定状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。不稳定状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。原则上，一些相对规则的原则上，一些相对规则的 -螺旋和螺旋和 -折叠分布在球状蛋白折叠分布在球状蛋白内部，且压积得很紧密，致使球状蛋白具有致密的结构；内部，且压积得很紧密，致使球状蛋白具有致密的结构；那些那些 -螺旋和螺旋和 -折叠叠规整性相对差一些的二级结构，转折叠叠规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的角和环状以及特定的“无规无规”卷曲，则更多地分布在球状卷曲，则更多地分布在球状蛋白外周。蛋白外周。值得指出的是在很多蛋白

7、质分子内部还存在着数量不同的值得指出的是在很多蛋白质分子内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性基因或负电性原子形成水分子，这些水分子也和一些极性基因或负电性原子形成氢键。其中一些也参与蛋白质功能的行使过程。氢键。其中一些也参与蛋白质功能的行使过程。球状蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多球状蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋白可及表面的面积约为同样大小球表面积的两倍数球状蛋白可及表面的面积约为同样大小球表面积的两倍。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 球状蛋白质分子的立体结构具有

8、高度特异性和高度灵球状蛋白质分子的立体结构具有高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异象特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异性结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常性结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。 在生物体内，构象变化，往往是该蛋白质分子与配基在生物体内，构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、

9、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白小分子激素和神经介质、血红蛋白O2等。因此，生物等。因此，生物体内的蛋白质总是处于一种可以相互转变的多种构象体内的蛋白质总是处于一种可以相互转变的多种构象平衡态。平衡态。 球状蛋白质分子表面并不光滑，常出现一些球状蛋白质分子表面并不光滑，常出现一些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”，“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴周围常具有疏水周围常具有疏水性，这些性，这些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是蛋白质可能是蛋白质(酶酶)的活的活性部位。性部位。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学硫氧还蛋白的结构硫氧还蛋白的

10、结构紧密结合水紧密结合水亲水性残基亲水性残基疏水性残基疏水性残基大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学第二节第二节 化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用 由于蛋白质分子量很大，在水中能够形成胶体溶液。由于蛋白质分子量很大，在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分

11、子杂质除去。 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。蛋白质会发生沉淀作用。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。中沉淀出来。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学沉沉淀淀作作用用的的类类型型可逆沉淀可逆沉

12、淀不可逆沉淀不可逆沉淀抗体抗体- -抗原沉淀抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶

13、解于水蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础疫功能的基础。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学一、无机物沉淀一、无机物沉淀当向蛋白质溶液中逐渐加入无机当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，开始蛋白质的溶解度增大，盐时，开始蛋白质的溶解度增大，是由于蛋白质的

14、活度系数降低的是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶。缘故，这种现象称为盐溶。但当继续加入电解质时，另一种但当继续加入电解质时，另一种因素起作用，使蛋白质的溶解度因素起作用，使蛋白质的溶解度减小，称为盐析。这是由于电解减小，称为盐析。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。多，就越易产生沉淀。（1）盐析）盐析牢固结

15、牢固结合水合水大量溶大量溶剂水层剂水层大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学含高价阴离子的盐，效果比含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好。阴离子的盐析效果有下价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序：列次序：柠檬酸盐柠檬酸盐PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-。 但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如硫酸铵。对于硫酸铵。对于1价阳离子则有下列次

16、序：价阳离子则有下列次序：NH4+K+Na+。 因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。但硫酸钠在但硫酸钠在40C 以下溶解度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋以下溶解度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上是白质。磷酸盐在中性范围内实际上是HPO42-和和H2PO4-的混合物，的混合物，其作用比其作用比PO43-差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定稳定, 在在2-3mol/L (NH4)2SO4中酶可保存几年。同时由于盐的浓中酶可保存几年。同时由于盐的浓度

17、高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析剂。硫酸度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高铵的缺点是水解后变酸，在高pH下会释放出氨，腐蚀性强；残下会释放出氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。因此必须除去。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学（2）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：为三

18、类： 第一类为第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和和Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。侧链结合。 第二类为第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和和Pb2+能和蛋白质分子表能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。 第三类为第三类为Ag+，Hg2+和和Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基能和蛋白质分子表面的巯基相结合。相结合。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 金属离子沉淀法

19、的优点是它们在稀溶液中对蛋白质金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。子交换树脂或螯合剂除去。 在这些离子中，应用较广的是在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和和Mn2+，而，而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如因为它们会使产品损失和引起污染。如Zn2+可用于可用于沉淀杆菌肽沉淀杆菌肽(作用于第作用于第4个组氨酸残基上个组氨酸残基上)和胰岛素；和胰岛素；Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血

20、清清蛋白等。用于分离乳酸，血清清蛋白等。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学二、等电点沉淀二、等电点沉淀 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所酸

21、，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。余的酸除去。 等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。比较敏感。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学pH对对 -乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学三、有机物沉淀三

22、、有机物沉淀 利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主要效应是水活度的降低。要效应是水活度的降低。 当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。常数降低，因而静电吸力增大。 在疏水区域附近近有序排

23、列的水分子可以为有机溶剂在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。 1. 有机溶剂有机溶剂大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而

24、且有机留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。 一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20-50%（V/V）之间。当蛋白质的溶液）之间。当蛋白质的溶液pH接近等电点时，接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶

25、剂的量较少。引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学2. 酚类化合物及有机酸沉淀酚类化合物及有机酸沉淀 当蛋白质溶液当蛋白质溶液pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。 这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。三硝基苯酚）、三氯乙

26、酸、磺酰水杨酸等。 单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀结构，最终导致聚集而沉淀 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof.

27、 Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学四、聚合物沉淀四、聚合物沉淀 许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉象和双水相的形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量淀，需加入大量PEG；而使高分子量的蛋白质沉淀，；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。加入的量较小。PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为是一种

28、特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。泛使用。 一般一般PEG的分子量需大于的分子量需大于4000，最常用的是，最常用的是6000和和20000。所用的。所用的PEG浓度通常为浓度通常为20%，浓度再高，会，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。PEG对后继对后继分离步骤影响较少，因此可以不必除去。分离步骤影响较少，因此可以不必除去。1. 非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学

29、生物学化学生物学2. 聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法 有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pH值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。 一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物如聚乙烯

30、亚胺和以聚苯乙烯为骨及一些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。聚丙烯酸能在架的季胺盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。聚丙烯酸能在pH 8.8时沉淀时沉淀90%以上的蛋白质，聚苯乙烯季胺盐能以上的蛋白质，聚苯乙烯季胺盐能在在pH 10.4时沉淀时沉淀95%的蛋白质。的蛋白质。 聚乙烯亚胺能与蛋白质的酸性区域形成复合物，在中聚乙烯亚胺能与蛋白质的酸性区域形成复合物，在中性时带正电，可在污水处理中作絮凝剂，也广泛用于性时带正电，可在污水处理中作絮凝剂，也广泛用于酶的纯化中。酶的纯化中。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu

31、化学生物学化学生物学第三节第三节 化学物质对蛋白质的稳定作用化学物质对蛋白质的稳定作用 许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在酶蛋白溶液在37C 放置的半衰期仅几个小时。放置的半衰期仅几个小时。 这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。的变性。 一、蛋白质不可逆失活的化学因素一、蛋白质不可

32、逆失活的化学因素1.强酸和强碱强酸和强碱大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。可逆失活。 另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易

33、被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质失去活性。重新排布，结果导致蛋白质失去活性。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学2.氧化剂氧化剂 各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面

34、的巯基、基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亚磺酸或磺氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。酸半胱氨酸。 分子氧、分子氧、H2O2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌过氧化氢、过氧化物

35、）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。作用主要也是造成蛋白质失活。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学3.去污剂和表面活性剂去污剂和表面活性剂 去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基磺酸钠，二烷基磺酸钠，SDS）单体加入到蛋白质溶液中时，去）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着加入量增加，污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着

36、加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学4.

37、变性剂变性剂 高浓度脲（高浓度脲（8-10mol/L）和盐酸胍（）和盐酸胍（6 mol/L）常常用）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。 （1）脲和盐酸胍）脲和盐酸胍大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学（2）有机溶剂）有机溶剂 水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质

38、失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡。而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡。 （3）螯合剂）螯合剂 结合金属离子的试剂，如结合金属离子的试剂，如EDTA等可以使金属酶、等可以使金属酶、金属蛋白失活，这是因为金属蛋白失活，这是因为EDTA与金属离子形成配与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。 失去金属辅助因子的酶或蛋白质可以引起蛋白质构失去

39、金属辅助因子的酶或蛋白质可以引起蛋白质构象发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。象发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。 但是，螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，但是，螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学5.重金属离子和巯基试剂重金属离子和巯基试剂 在金属离子对蛋白质的沉淀作用中，一些重金属离在金属离子对蛋白质的沉淀作用中，一些重金属离子，如子，如Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质分子中的半胱能与蛋白质分

40、子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。 巯基试剂，如巯基乙醇等通过还原蛋白质分子内的巯基试剂，如巯基乙醇等通过还原蛋白质分子内的二硫键而使蛋白质失去活性，但这个过程一般是可二硫键而使蛋白质失去活性，但这个过程一般是可逆的。而低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质中逆的。而低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质中的巯基作用，形成混合二硫键，造成蛋白质结构发的巯基作用，形成混合二硫键，造成蛋白质结构发生变化，导致其失活。生变化，导致其失活。 大连民族学院生命科学学院大连民族学

41、院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学LysArg水大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学蛋白质不可逆失活的化学因素蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱强酸和强碱 强的酸碱可强的酸碱可以改变蛋白以改变蛋白质溶液的质溶液的pH引起蛋白质引起蛋白质表面必需基表面必需基团的电离，团的电离，使蛋白质的使蛋白质的空间结构发空间结构发生变化，造生变化，造成蛋白质分成蛋白质分子聚集，导子聚集，导致变性。致变性。 氧化剂氧化剂 氧化剂甲硫氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸和胱氨氨酸和胱氨酸残基。酪酸残基。酪氨酸

42、侧链的氨酸侧链的酚羟基可以酚羟基可以被氧化成醌被氧化成醌再与巯基、再与巯基、氨基发生迈氨基发生迈克尔加成反克尔加成反应形成交联应形成交联产物。产物。 表面活性剂表面活性剂变性剂变性剂 重金属离子重金属离子去污剂与蛋去污剂与蛋白质表面的白质表面的疏水区域结疏水区域结合，导致蛋合，导致蛋白质伸展，白质伸展，分子内部的分子内部的疏水性氨基疏水性氨基酸残基暴露酸残基暴露从而使蛋白从而使蛋白质发生不可质发生不可逆变性。逆变性。 脲或盐酸胍脲或盐酸胍与蛋白质多与蛋白质多肽链作用，肽链作用，破坏了蛋白破坏了蛋白质分子内维质分子内维持其二级结持其二级结构和高级结构和高级结构的氢键。构的氢键。有机溶剂也有机溶剂

43、也会会引起蛋白引起蛋白质变性失活质变性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋能与蛋白质分子中白质分子中的半胱氨酸的半胱氨酸的巯基、组的巯基、组氨酸的咪唑氨酸的咪唑基以及色氨基以及色氨酸的吲哚基酸的吲哚基反应，使蛋反应，使蛋白质不可逆白质不可逆沉淀而变性沉淀而变性失活。失活。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学二、化学物质对蛋白质的稳定作用二、化学物质对蛋白质的稳定作用 蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋白质等存保持其生物活性的能力。根据

44、生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。 通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。的结构功能与稳定性的关系等。 在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。常用的方法有：通过化学方法使蛋白质稳定。常用的方法有： 固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）

45、；体、高分子载体）； 添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等；变性剂变性等； 化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学稳定剂稳定剂 共溶剂共溶剂 糖类，醇糖类，醇氨基酸及氨基酸及其衍生物其衍生物无机盐，无机盐，甘油，聚甘油，聚乙二醇等乙二醇等常用常用1-4M1-4M浓度共溶浓度共溶剂来稳定剂来稳定蛋白质和蛋白质和细胞器。细胞器。 抗氧化剂抗氧化剂 底物、辅酶底物、辅酶 金属离子金属离子 化学交

46、联剂化学交联剂半胱氨酸，半胱氨酸，2-2-巯基乙醇巯基乙醇还原谷胱甘还原谷胱甘肽，二巯基肽，二巯基赤藓醇等巯赤藓醇等巯基试剂可防基试剂可防止巯基氧化止巯基氧化植物抗氧化植物抗氧化剂如儿茶酚剂如儿茶酚黄酮等也具黄酮等也具有保护作用有保护作用酶可被底酶可被底物辅酶、物辅酶、竞争性抑竞争性抑制剂及反制剂及反应产物等应产物等所稳定。所稳定。金属离子不金属离子不仅可以影响仅可以影响酶的活性，酶的活性，还可以影响还可以影响酶的稳定性酶的稳定性如如CaCa2+2+多位多位点结合使得点结合使得蛋白质分子蛋白质分子成为紧密的成为紧密的活性形式。活性形式。交联剂可在交联剂可在相隔较近的相隔较近的两个氨基酸两个氨基

47、酸残基之间，残基之间，或蛋白质与或蛋白质与其他分子之其他分子之间（如固定间（如固定化载体）发化载体）发生交联反应生交联反应使蛋白质的使蛋白质的构象稳定。构象稳定。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学三、化学物质的共价修饰作用三、化学物质的共价修饰作用 化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。

48、化合修饰的方法。 该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。手段。 1.1.生物体内蛋白质加合物的形成生物体内蛋白质加合物的形成 许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞大分子的亲核部位同细胞大分子的亲核部位(如蛋白质的巯基如蛋白质的巯基)发生不可发生不可逆结合具有密切关系。逆结合具有密切关系。大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学 当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子

49、，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致基化或芳基化，即导致DNA损伤、蛋白质正常功能损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。价结合。 (1)可与蛋白质发生反应的化合物可与蛋白质发生反应的化合物 除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内

50、生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白质分子中的亲核基团、如蛋白质分子中的亲核基团、DNA、RNA及一些小及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学(2)蛋白质分子中的可反应基团蛋白质分子中的可反应基团 致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰

51、胺等，与蛋白质作用时，氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。应的相对速率。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学试剂类型试剂类型化合物或前体化合物或前体反应机制反应机制烷基化烷基化芳香基化芳香基化卤代物卤代物亲核取代亲核取代环氧化物环氧化物硫酸烷基酯硫酸烷基酯活泼的烯烃活泼的烯烃1,4-1,4-加成加成羰基化合物羰基化合物醛醛形成希夫碱形成希夫碱酰基化酰基化有机酸酐、酰氯等有机酸酐、酰氯等亲核取代或加成亲核取代或加成磷

52、酰化磷酰化有机磷有机磷亲核取代亲核取代自由基自由基OH、CCl3自由基反应自由基反应具有亲电氮化合物具有亲电氮化合物芳香胺芳香胺 亲核取代亲核取代大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学2.氨基酸残基侧链基团的修饰氨基酸残基侧链基团的修饰 蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。测活性部位的结

53、构。 理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定的理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。化。 在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。该蛋白质分子中的功能。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学3.巯基的化学修饰巯基的化学修饰 5,5-二硫二硫-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸(DT

54、NB)，又称为，又称为Ellman试剂，试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可与巯基反可与巯基反应形成二硫键，产生的应形成二硫键，产生的5-巯基巯基-2-硝基苯甲酸阴离子在硝基苯甲酸阴离子在412nm具有很强的吸收，可以通过光吸收变化监测反应具有很强的吸收，可以通过光吸收变化监测反应程度。程度。有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水形成羟基衍生物，用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水形成羟基衍生物，与巯基相互作用时与巯基相互作用时255nm处光吸收具有较大的增强效

55、应。处光吸收具有较大的增强效应。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学4.氨基的化学修饰氨基的化学修饰 有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸与赖氨酸残基反应，在残基反应，在420nm和和367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。 在蛋白质序列分析中，用于多肽链在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-末端残基的测定末端残基的测定的化合修饰方法的化合修饰方法2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DN

56、FD)法、丹磺酰法、丹磺酰氯氯(DNS)法和法和)苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基法都是常用的氨基修饰方法修饰方法。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学5.羧基的化学修饰羧基的化学修饰 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。在比较温和的条件下就可以进行。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化

57、学生物学化学生物学6.咪唑基的化合修饰咪唑基的化合修饰 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修饰组氨酸残基的是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的1个氮个氮羧乙基化，并且使得在羧乙基化，并且使得在240nm处的光吸收增加。处的光吸收增加。该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。成组氨酸残基。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物

58、学化学生物学四、蛋白质光谱探针四、蛋白质光谱探针 蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。 所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而

59、可以提供蛋白质浓度或结构方面质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。的信息。 蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针。分子光谱探针。 大连民族学院生命科学学院大连民族学院生命科学学院Prof. Dr. J.T. Liu化学生物学化学生物学蛋蛋白白质质吸吸光光探探针针金金属属探探针针双缩脲在碱性溶液中与双缩脲在碱性溶液中与 Cu2+生成紫生成紫红色化合物的反应。肽和蛋白质化红色化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有双缩脲反应，生成紫红色合物都有双缩脲反应，生成紫红色化合物，在化合物，在540nm具有光吸收。具有光吸收。 双缩脲法双缩脲法Folin-Lowry法法 将双缩脲试剂和将双缩脲试剂和Folin酚试剂酚试剂(磷钼磷钼酸盐磷