微生物学_09b微生物与基因工程

1、第九章第九章 微生物与基因工程微生物与基因工程基因工程技术基因工程技术基因工程（基因工程（genetic engineering)：把分离到的或：把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。或令生物表现出新的形状。基因工程大事记基因工程大事记1973 Cohen1973 Cohen和和BoyerBoyer第一次将重组体第一次将重组体DNADNA转化大肠杆菌，转化大肠杆菌，实现了实现了DNADNA的分子克隆的分子克隆; ;1978 G

2、enentech1978 Genentech公司公司-人胰岛素人胰岛素-世界上第一种基因世界上第一种基因工程蛋白药物工程蛋白药物 1982 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准重组人胰岛素在英、美获准使用使用 1985 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基转基因鱼因鱼 1993 1993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所英国罗斯林研究所-克隆羊多莉克隆羊多莉1999.9 中国获准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划, 负责测定负责测定人类基因组全部序列的人类

3、基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息9.1 基因工程概述基因工程概述三项重要技术为基因工程奠定了基础三项重要技术为基因工程奠定了基础:1967-1970年年R.Yuan和和H.O.Smith等发现的等发现的限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶为基因工程提供了有力的工具；为基因工程提供了有力的工具；1972年年Berg等将等将SV-40病毒病毒DNA与噬菌体与噬菌体P22DNA在体外在体外重组重组成功；成功；1973年年Cohen和和Boyer第一次将重组体第一次将重组体DNA

4、转转化大肠杆菌，实现了化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆的分子克隆; 1977年年Boyer等首先等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽；肽；1975-1977年年Sanger、Maxam和和Gilbert先后发明了三种先后发明了三种DNA序列的快速测定法序列的快速测定法；90年代全自动核酸测序仪问世；年代全自动核酸测序仪问世；一、基因工程基本过程一、基因工程基本过程1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。、目的基因的提取：分离或合成外源基因。2、体外重组：

5、外源基因与载体体外连接，构建重、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组组DNA分子；分子；3、转化：重组、转化：重组DNA分子导入细胞。分子导入细胞。4、扩增该克隆、扩增该克隆DNA。5、筛选与鉴定；、筛选与鉴定；6、基因表达：控制适当条件，外源、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。表达。7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。获得表达产物或转基因动物、转基因植物。一切基因工程操作都离不开微生物一切基因工程操作都离不开微生物1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成的。而成的。2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物

6、中得到的。、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。3、微生物细胞是基因克隆的宿主。、微生物细胞是基因克隆的宿主。4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。6、模式生物提供基础理论。、模式生物提供基础理论。二、微生物与基因工程关系二、微生物与基因工程关系9.2 微生物与克隆载体微生物与克隆载体载体载体：克隆载体、表达载体、穿梭载体：克隆载体、表达载体、穿梭载体克隆载体克隆载体：外源：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适片段

7、进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以扩增外源种以扩增外源DNA为目的载体，称为为目的载体，称为克隆载体克隆载体。克隆载体应具备的性质克隆载体应具备的性质1、可独立自主复制，具备复制原点；、可独立自主复制，具备复制原点；2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。以便于

8、对阳性克隆的鉴别和筛选。目前克隆载体种类目前克隆载体种类质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体噬菌体载体真核细胞的克隆载体真核细胞的克隆载体人工染色体。人工染色体。一、质粒载体一、质粒载体1、特点：、特点：（1）具有独立复制起点；）具有独立复制起点；（2）具有较小的相对分子质量。）具有较小的相对分子质量。1200kb，外源，外源DNA15kb；（3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终浓度浓度1020g/ml，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成合成终止，

9、质粒复制正常进行，可达数千个拷贝；终止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝；（4）具有便于选择的标记；）具有便于选择的标记；（5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞；）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞；（6）具有安全性。）具有安全性。pBR322的结构特征环状双链环状双链DNA分子，由分子，由4361bp组成，松驰型组成，松驰型;colE复制起点，外源复制起点，外源DNA大小为大小为5kb左右左右;四环素抗性基因（四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因）、氨苄青霉素抗性基因（Ampr）;24单一酶切位点（单一酶切位点（ Tetr中中7个，个， Ampr中

10、中3个）。个）。插入失活筛选转化子 插入失活插入失活：pBR322抗生素抗性基因内有许多单一切点的抗生素抗性基因内有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子，插入新的限制性位点，可以用来切开分子，插入新的DNA片段，新片段，新DNA片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象称称如如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。筛选重组筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于按照以下方法进行，将转化细胞培养

11、于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。目的克隆。pUC质粒载体一个复制起始位点一个复制起始位点具有更小的分子量：具有更小的分子量：2.8kb更高的拷贝数，每个细胞大约更高的拷贝数，每个细胞大约500各拷贝各拷贝具有多克隆位点具有多克隆位点MCS区段区段携带了氨卞青霉素抗性基因（携带了氨卞青霉素抗性基因（ampR）多克隆位点区位于多克隆位点区位于lacZ基因中，在此位点上插入外源基因会基因中，在此位点上插入外源基因会导致导致

12、lacZ基因失活，可利用基因失活，可利用蓝白斑筛选蓝白斑筛选重组子重组子 。质粒的不足（1）外源）外源DNA15kb。（2）转化效率低，约）转化效率低，约0.1的转化率。的转化率。二、二、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体的优点：噬菌体的优点：（1）遗传背景清楚；）遗传背景清楚；（2）容纳外源）容纳外源DNA23kb。（3）高感染率）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。，体外包装上外壳蛋白。缺点：缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位分子很大；限制酶有很多切点，且多位于必需基因内。于必需基因内。噬菌体克隆载体的构建a、缩短长度、缩短长度野生型野生型DNA包装的上限为包装的上限为50.

13、5kb，本身，本身长度为长度为48.5kb，插入片段至多为，插入片段至多为2.0kb，如果将其缩短便能够提高装载量。如果将其缩短便能够提高装载量。I 插入型载体经改造后的长度为经改造后的长度为37kb，为包装的下限，为包装的下限，插入片段最大为插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）由于该类载体重组与否均可包装，因而为由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分组子与非重组子必须携带标记基因。区分组子与非重组子必须携带标记基因。II 取代型载体经改造后的长度约为经改造后的长度约为40kb，含两个酶切口，两者，含两个酶切口，两者间的距离为间的距离为14kb，然后用外源，然后用外源DNA片段取

14、代之。片段取代之。包装下限为包装下限为37kb，这类载体不需要标记基因，因为空载的载体这类载体不需要标记基因，因为空载的载体DNA只有只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。胞中去。b 删除重复的酶切口插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天然的多了也不行，而天然的DNA上有许多重复的酶切上有许多重复的酶切口，如：口，如：EcoRI 5个，个，HindIII 7个，这些多余的酶个，这些多余的酶切口必须被删

15、除切口必须被删除噬菌体载体的优点可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌装载外源装载外源DNA的量大（的量大（23kb）重组重组-DNA的筛选提取方便的筛选提取方便噬菌体载体常用于构建基因文库。噬菌体载体常用于构建基因文库。柯斯质粒载体（COS载体，粘粒载体）考斯质粒是含考斯质粒是含有有-DNA两两端端cos区的质区的质粒粒考斯质粒的构建由于由于 -DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序序cos区。将这段区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的与质粒连在一起，构建的重组质重组质 粒，可装载外源粒，可装载外源DNA（45.5kb

16、)，它仍可，它仍可象象-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。复制。考斯质粒的优点能象能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体一样体外包装，并高效导入受体细胞细胞可以装载更大的外源可以装载更大的外源DNA片段，可装片段，可装载载45.5kb。携带质粒的选择标记，便于筛选携带质粒的选择标记，便于筛选有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。M13噬菌体载体1、 M13 噬菌体基本特点：噬菌体基本特点：（1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只

17、感染雄性大肠杆菌。感染噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；（2） M13 噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链 DNA ，由，由 6407 的碱基组的碱基组成成 ；（3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于，用于 DNA 的复制，的复制，因此这种双链因此这种双链 DNA 称为复制型称

18、为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即，即 RF DNA ；M13噬菌体的改造 野生型野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生不适于作为克隆载体，因此人们对野生型型M13进行了改造，构建了一系列进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。克隆载体。 在在M13基因组中，除基因间隔区（基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他）外，其他均为复制和组装所必需的基因。均为复制和组装所必需的基因。 外源外源DNA插入插入IG区，可不影响区，可不影响M13活动，因此对活动，因此对野生型野生型M13的改造主要在的改造主要在IG区中进行。区中进行。 插入半乳糖苷酶选择标记在在IG

19、区中插入区中插入半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端一小段编码序列及端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码其调控序列，该序列编码半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽，肽，肽可与大肠杆菌肽可与大肠杆菌LacZ突变基因突变基因 M15进行进行互补，互补，产生具有活性的产生具有活性的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。若将若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷半乳糖苷(IPTG)和呈色物质和呈色物质5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷(Xgal)培养基的平板上时，可形成蓝色培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。噬菌斑。 插入一小段多克隆位点区在在肽的编码区内插入一小段密

20、集限制酶单一位点肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的的DNA片段，当外源片段，当外源DNA插入到这一区段，则会插入到这一区段，则会破坏破坏互补作用。这时若将互补作用。这时若将M13（含外源（含外源DNA）和）和宿主细胞涂布在含有宿主细胞涂布在含有IPTG和和Xgal培养基的平板培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。上，则形成无色噬菌斑。M13载体克隆外源载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适的能力较小，一般只适于克隆于克隆300400bp的外源的外源DNA片段；片段；它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序

21、用。因此，它主要被用于制备测序用单链单链DNA模板、特异的单链模板、特异的单链DNA探针，定位探针，定位诱变等。诱变等。表9-1 几类大肠杆菌克隆载体比较载体类型载体类型 克隆外源克隆外源DNA片段片段大小大小 主要用途主要用途 质粒载体质粒载体 15kb 克隆和表达外源基因；克隆和表达外源基因；DNA测序测序 噬菌体载噬菌体载体体 23kb 构建基因文库和构建基因文库和cDNA文库文库 柯斯质粒柯斯质粒载体载体 45kb 构建基因文库构建基因文库 M13载体载体 300400bp 制备单链制备单链DNA；定位诱变；定位诱变；噬菌体展示噬菌体展示 三、真核生物的克隆载体三、真核生物的克隆载体1

22、.酵母质粒载体酵母质粒载体酵母质粒载体都是利用其酵母质粒载体都是利用其2m质粒和其酵母染质粒和其酵母染色体组分与细菌质粒色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可构建而成的。可分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。主要有三种：附加体质粒、主要有三种：附加体质粒、复制质粒、整合质粒复制质粒、整合质粒（1）附加体质粒（episomal plasmid） 结构：结构：pBR322的复制起点、的复制起点、Ampr（氨苄（氨苄青霉素抗性基因）；青霉素抗性基因）；2m的复制起点；酵的复制起点；酵母选择标记的母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合基因（尿嘧啶核苷酸合

23、成酶基因成酶基因3）。）。 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。（2）复制质粒含有：来自细菌质粒含有：来自细菌质粒pBR322的复制起点；氨苄青的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因）和四环素抗性基因（Tetr）。来自酵母染色体的自主复制序列）。来自酵母染色体的自主复制序列（ARS）；作为酵母选择标记的）；作为酵母选择标记的URA3基因和基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因基因（色氨酸合成酶基因1）。）。这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数复

24、制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。的质粒。（3）整合质粒含有：来自含有：来自pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（性基因（Ampr）、四环素抗性基因（）、四环素抗性基因（Tetr）。来）。来自酵母的自酵母的URA3基因；它既可以作为酵母细胞的基因；它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体到酵

25、母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。的一个片段。2.真核生物病毒载体（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病毒如毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。改造后的衍生物作为基因载体。（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）；）；其次具有高表达效率（其次具有高表达效率（25）；安全，仅感染）；安全，仅感染无脊椎动物；无脊椎动物；（3）植物病毒载体）植物病毒载体四、人工染色体四、人工染色体酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外

26、源）：能容纳最大外源DNA片段。片段。1、组成：着丝粒（、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（）、端粒（telomere， TEL）、酵母自主复制序列（）、酵母自主复制序列（ARS）、选择性标记（如）、选择性标记（如URA3）。）。2、功能：大片段克隆（、功能：大片段克隆（100万万bp），多用于真核生物基因库的载），多用于真核生物基因库的载体。体。3、相关：细菌人工染色体（、相关：细菌人工染色体（BAC）。）。常用工具酶种类常用工具酶种类 内切酶内切酶 把DNA长链切割为短的片段 连接酶连接酶 将2段DNA片段拼接起来 聚合酶聚合酶 催化合成形成核酸链 末端转移酶末端转移酶

27、片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶核酸酶 水解酶，非专一性 反向转录酶反向转录酶 逆转录酶9.3 微生物与基因工程工具酶微生物与基因工程工具酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶 1、限制性内切酶的定义、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链分，具有识别双链DNA分子中的某种分子中的某种特定核酸特定核酸序列序列并由此切割并由此切割DNA双链结构的酶统称为双链结构的酶统称为限制限制性内切酶。性内切酶。限制性内切酶的发现 Luria和和Human发现细菌能将外来的发现细菌能将外来的DNA片段在某片段在某些专一位点上切断，从而保证

28、其不被外来噬菌体所些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制修饰限制修饰。Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为，这个酶被命名为Hind I,这这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。是第一个分离到的限制性内切核酸酶。3、限制性核酸内切酶的命名 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头

29、两个字母组成的三个斜体字母作略母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌例如：从流感嗜血杆菌d株（株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到）中先后分离到3种限制酶，则分别种限制酶，则分别命名为命名为Hind、Hind和和Hind。4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型：限制性内切酶可分为三大类型：类型类型I和类型和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。被应用。类

30、型类型II的特点的特点: 识别位点严格专一；识别序列的碱基识别位点严格专一；识别序列的碱基数一般为数一般为4、6、8个个bp；识别位点经常是一种回；识别位点经常是一种回文序列的文序列的DNA；是；是DNA重组技术最为常用的工具重组技术最为常用的工具酶。酶。寡核苷酸顺序具有二冲旋转对称轴，又称为寡核苷酸顺序具有二冲旋转对称轴，又称为回文顺序回文顺序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些对称顺序被一个或几个非特定的核也有一些对称顺序被一个或几个非特定的核苷酸间隔开。苷酸间隔开。N-四种均可四种均可 Py-嘧啶嘧啶 Pu-嘌呤嘌呤如如GTPyPuAC H

31、ind I6、限制性内切酶的切割方式就切割位点相对于对称轴的位置而言就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有切割方式有三种三种:在对称轴在对称轴5 侧切割产生侧切割产生5 粘端粘端在对称轴在对称轴3 侧切割产生侧切割产生3 粘端粘端在对称轴处切割产生平在对称轴处切割产生平二、二、DNA连接酶连接酶配对的碱基产生的氢键还不足以把两个配对的碱基产生的氢键还不足以把两个DNA分子分子拴在一起，还需要通过拴在一起，还需要通过DNA连接酶在连接酶在3羟基和羟基和5磷磷酸基团之间形成新的酸基团之间形成新的磷酸二酯键磷酸二酯键。大多数大多数DNA连接酶都是从连接酶都是从T4噬菌体中分离出来的，噬菌体中分

32、离出来的，它可以催化在两条它可以催化在两条DNA链的末端形成磷酸二酯键，链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两条包括粘性末端碱基配对的两条DNA链和末端都是链和末端都是平末端的两条平末端的两条DNA链链其它常用工具酶3. Tag DNA聚合酶：是一种耐热的依赖聚合酶：是一种耐热的依赖于于DNA的的DNA聚合酶，具有聚合酶，具有5 3聚聚合酶活性，该酶最适反应温度为合酶活性，该酶最适反应温度为7580 ，主要用途是进行，主要用途是进行PCR反应。反应。4. 逆转录酶（依赖于逆转录酶（依赖于RNA的的DNA聚合酶）聚合酶）主要作用是将主要作用是将mRNA反转录成反转录成cDNA（二）碱性

33、磷酸酶其作用是去除其作用是去除DNA、RNA的的5磷酸根（磷酸根（ 5-P），以防自身环化；另外在用），以防自身环化；另外在用32P标记标记5末末端前，可先用其去除端前，可先用其去除DNA或或RNA上的上的5- P（三）核酸酶S1核酸酶：主要用于去除核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而产生片段粘末端而产生平端；打开平端；打开cDNA中发夹结构，使其成平端。中发夹结构，使其成平端。核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解：在质粒提取时降解RNA；从从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的杂交体中去除未杂交的RNA区。区。9.4 微生物作为克隆载体的宿主微生物作为克隆载体的宿主一、宿

34、主的基本要求与性质一、宿主的基本要求与性质1、能够高效吸收外源、能够高效吸收外源DNA；2、具有使外源、具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；进行高效复制的酶系统；3、不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修、不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源饰的外源DNA发生降解；发生降解；4、一般为重组缺陷型（、一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体）菌株，使克隆载体DNA与与宿主染色体宿主染色体DNA之间不发生同源重组；之间不发生同源重组；5、便于进行基因操作和筛选；、便于进行基因操作和筛选；6、具有安全性。、具有安全性。二、原核生物宿主二、原核生物宿主1、首先应根

35、据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相、首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞：应的宿主细胞：噬菌体载体噬菌体载体E.coli k12菌株、菌株、M13含含有有F因子的雄性大肠杆菌。因子的雄性大肠杆菌。2、其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应、其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。与载体基因相对应。3. 最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。尽量避免重组体从实验室逃逸出去。三、真核生物宿主（酿酒酵母）三、真核生物宿主（酿酒酵母）利

36、用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；控的研究；第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。四、外源基因导入宿主四、外源基因导入宿主1、外源、外源DNA导入导入原核细胞导入导入原核细胞（1）转化和转染：外源）转化和转染：外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；外源通过转化导入原核细

37、胞；外源 DNA构建成重组噬菌体构建成重组噬菌体DNA或或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入 宿主细胞。宿主细胞。感受态细胞：用氯化钙处理宿主细胞，使细胞变得易于吸引外感受态细胞：用氯化钙处理宿主细胞，使细胞变得易于吸引外源源DNA。（2）DNA的侵染（体外包装转染技术）的侵染（体外包装转染技术）体外包装（将重组体外包装（将重组DNA分子与分子与噬菌体的头部、尾部以及有关噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，组装成具感染力的包装蛋白混合，组装成具感染力的噬菌体粒子）感染宿主。噬菌体粒子）感染宿主。较转染效率要高出较转染效率要高出104105倍。倍。2、外源、

38、外源DNA导入真核细胞导入真核细胞（1）外源）外源DNA导入酵母细胞导入酵母细胞酵母细胞酵母细胞原生质体原生质体蜗牛酶蜗牛酶CaCl2和聚乙二醇和聚乙二醇复合体（含复合体（含DNA的原生质体）的原生质体）长出有壁细胞长出有壁细胞再生培养基中再生培养基中（2）外源）外源DNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞 其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。（3）外）外DNA导入植物细胞：导入植物细胞： 除了微量注射法及电除了微量注射法及电穿孔法可将外源穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。导入植物细胞外。 还有两种方法，一种是基因枪法或称微弹枪法；还有两种方法，一种是基因枪

39、法或称微弹枪法；另一种是将含有重组另一种是将含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片培原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片培养（即叶片培养法）。养（即叶片培养法）。五、基因文库与五、基因文库与cDNA文库的构建文库的构建利用重组利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或或cDNA文库文库(cDNA li

40、brary)1. 基因文库的构建所谓基因文库是指生物染色体基因组各所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的组中某一特定的DNA片段。片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部组全部遗传信息（即全部DNA序列）。序列）。2、基因文库的构建步骤：、基因文库的构建步骤：（1）从组织或细胞提取基因组）从组织或细胞提取基因组DNA；（2）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度DNA 片段，经分级选出一定

41、大小合适克隆片段，经分级选出一定大小合适克隆DNA片段；片段；（3）选择容载量较大的克隆载体，通常采用）选择容载量较大的克隆载体，通常采用噬菌体或噬菌体或 柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；（4）将基因组）将基因组DNA片段与载体进行体外连接；片段与载体进行体外连接；（5）重组体）重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组直接转化细菌或用体外包装的重组噬噬 菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组 DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。2. cDNA文库构建文库构建所谓

42、所谓cDNA文库是指生物体全部文库是指生物体全部mRNA的的cDNA克隆总体。克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。信息。由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为逆转录为cDNA，那么

43、所构建的，那么所构建的cDNA文库的库容量文库的库容量相应比基因文库小。相应比基因文库小。构建构建cDNA文库的主要步骤：文库的主要步骤：从生物体或细胞中提取从生物体或细胞中提取mRNA。利用逆转录酶以寡聚利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合或随机寡聚核苷酸为引物合成成cDNA的第一条链。的第一条链。利用利用DNA聚合酶聚合酶I，以，以cDNA第一条链作为模板，用适第一条链作为模板，用适当引物合成当引物合成cDNA第二条链第二条链;常用常用RNA酶酶H在杂交分子在杂交分子的的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物引物;或是除去杂交分子的或是

44、除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可后，加入随机引物，即可合成第二条链。合成第二条链。cDNA与载体的体外连接。与载体的体外连接。噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。隆载体可选用质粒或病毒载体。六、重组体的筛选与鉴定六、重组体的筛选与鉴定1. 重组体表型特征的鉴定重组体表型特征的鉴定 2. 重组重组DNA分子结构特征的鉴定分子结构特征的鉴定 3. 外源基因表达产物的鉴定外源基因表达产物的鉴定 1. 重组体表型特征

45、的鉴定(1) 抗生素平板法抗生素平板法 (2) 插入失活法插入失活法 (3) 插入表达法插入表达法 (4) -半乳糖苷酶显色反应法半乳糖苷酶显色反应法抗生素平板法缺点缺点:假阳性高假阳性高插入失活法 因外源因外源 DNA 的插入而导致基因失活的现的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（象，称为插入失活（ insertional inactivation ）插入表达法 在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源当外源 DNA 片段插入该负控制序列中，使负控制片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而序列失活，

46、因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。得到表达。例如质粒例如质粒 pTR262 有一个负调控的有一个负调控的 cI 基因，当外基因，当外源源 DNA 片段插入片段插入 cI 基因中的基因中的 BcII 或或 HindIII 位点，位点，造成造成 cI 基因失活，位于基因失活，位于 cI 基因下游的基因下游的 tet 基因基因（受（受 cI 基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落； - 半乳糖苷酶显色反应法 兰兰-白斑筛选：某些载体，如白斑筛选：某些载体，如M13，P

47、UC系列，系列，PGEM质粒系列等，都带有质粒系列等，都带有lac Z基因的一段序列，基因的一段序列，编码编码半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽；而宿主细胞为肽；而宿主细胞为Lac Z M15的突变株时，的突变株时， 肽可与肽可与M15进行进行互补，产互补，产生具有活性的生具有活性的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。若将转化细胞涂布在含有异丙基硫代若将转化细胞涂布在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷半乳糖苷(IPTG)和呈色物质和呈色物质5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷(Xgal)培养基的平板上时，可形成蓝色菌落。培养基的平板上时，可形成蓝色菌落。当外源当外源DNA插入到这一区段，则会破坏插入到

48、这一区段，则会破坏互互补作用。这时若将转化细胞涂布在含有补作用。这时若将转化细胞涂布在含有IPTG和和Xgal培养基的平板上，则形成无色培养基的平板上，则形成无色菌落。菌落。2. 重组DNA分子结构特征的鉴定菌落（或噬菌斑）原位杂交（菌落（或噬菌斑）原位杂交（ in situ hybridization ） 内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定 PCR 鉴定鉴定 菌落（或噬菌斑）原位杂交将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。

49、维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出解，释放出 DNA 。再用碱处理，使再用碱处理，使 DNA 变性，经烘烤将变性变性，经烘烤将变性 DNA 固定于滤膜固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。隆。内切酶图谱鉴定 将初步筛选的阳

50、性克隆小量培养后，提取重将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体组质粒或重组噬菌体 DNA ，用，用 12 种内切种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入 DNA 片段大小。片段大小。 双酶切鉴定重组质粒双酶切鉴定重组质粒 PCR 鉴定 通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒 DNA 作为模板进行作为模板进行 PCR 分析，可快速测出插入分析，可快速测出插入 DNA 片段大小及鉴定其序列特异性。片段大小及鉴定其序列特异性。 DNA 序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须最后为了确证目的基因序列

51、的正确性，必须对重组体的对重组体的 DNA 进行序列测定进行序列测定 外源基因表达产物的鉴定 表达产物免疫活性测定表达产物免疫活性测定 表达产物生物活性检查表达产物生物活性检查 表达产物氨基酸序列测定表达产物氨基酸序列测定 表达产物免疫活性测定Western blot with anti-Sak antisera (rabbit)表达产物生物活性检查表达产物氨基酸序列测定一般分析一般分析N-末端（末端（15个残基序列）和个残基序列）和C-末末端（一般端（一般5个）氨基酸鉴别蛋白质的性质和个）氨基酸鉴别蛋白质的性质和同质性；同质性；9.5 表达载体的构建表达载体的构建 基因工程的主要目的是使外源

52、基因能在细菌、酵基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。的遗传性状。 所谓表达载体（所谓表达载体（ expression vector ）是指宿主）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 用原核细胞表达真核生物基因时，应注意的问题用原核细胞表达真核生物基因时，应注意的问题 基因的编码区必须是连续的，

53、因此要用切除内含基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的子的 cDNA ； 基因必须置于原核细胞启动子、终止子和基因必须置于原核细胞启动子、终止子和 SD 序序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别；效识别； 产生的产生的 mRNA 必须相对稳定并能有效进行翻译和必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。酶降解。 一一 主要调控元件主要调控元件 启动子启动子核糖体的结合位点核糖体的结合位点转录终止信号转录终止信号（ 1 ）、启动子）、启动子 （ promot

54、er ） 启动子是指启动子是指 RNA 聚合酶结合于聚合酶结合于 DNA 并起始合成并起始合成 RNA 的的一段一段 DNA 控制序列。控制序列。原核基因启动子位于转录起点（原核基因启动子位于转录起点（ transcription initiation ）上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。列组成。一个称为一个称为 -10 区，位于转录起点上游约区，位于转录起点上游约 10bp 处；处； RNA 聚合酶于该处解开聚合酶于该处解开 DNA 双链，并决定转录起点；双链，并决定转录起点；另一个称为另一个称为 -35 区，位于转录

55、起点上游约区，位于转录起点上游约 35bp 处，是处，是 RNA 聚合酶识别并结合的位点。聚合酶识别并结合的位点。 原核表达系统中常用启动子原核表达系统中常用启动子 lac 启动子，是乳糖操纵子的启动子，受启动子，是乳糖操纵子的启动子，受 lac I 编码的阻遏编码的阻遏蛋白调节控制；蛋白调节控制； trp 启动子，是色氨酸操纵子启动子，受启动子，是色氨酸操纵子启动子，受 trpR 编码的阻遏编码的阻遏蛋白调控；蛋白调控； tac 启动子，由启动子，由 lac 启动子的启动子的 -10 区和区和 trp 启动子启动子 -35 区融区融合而成，汇合了合而成，汇合了 lac 和和 trp 两者优点

56、，是一个很强的启动子，两者优点，是一个很强的启动子，同样受同样受 LacI 阻遏蛋白调控阻遏蛋白调控 。 P(L 、 R) 启动子，是启动子，是噬菌体左、右向启动子，其温度敏感噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控；的阻遏蛋白受温度调控； T 7 噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被只被 T 7 RNA 聚合酶所识别。聚合酶所识别。 核糖体结合位点核糖体结合位点原核微生物的原核微生物的 mRNA 结合核糖体的序列最初是由结合核糖体的序列最初是由夏英（夏英（ Shine ）和达尔加诺（）和达尔加诺（ Dalgarmo

57、）发现的，）发现的，因此称为因此称为 SD 序列序列;在大肠杆菌中，核糖体结合点包括起始密码子在大肠杆菌中，核糖体结合点包括起始密码子 (AUG) 及位于起始密码子上游及位于起始密码子上游 11bp 处，长度处，长度为为 bp 的序列的序列;这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与核糖体小亚基上这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与核糖体小亚基上 16S rRNA 3 端一段富含嘧啶的保守序列互补，从端一段富含嘧啶的保守序列互补，从而带动核糖体与而带动核糖体与 mRNA 的结合。的结合。 转录终止子转录终止子转录终止子指一段位于基因或操纵子的转录终止子指一段位于基因或操纵子的 末端，末端，具有终止转录功能的特定

58、具有终止转录功能的特定 DNA 序列。高效表达载序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的体应该含有终止子，因为合成的 mRNA 过长，不过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使仅消耗细胞内的底物和能量，且易使 mRNA 形成形成妨碍翻译的二级结构。妨碍翻译的二级结构。 密码子的偏爱性密码子的偏爱性 由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。子。在原核生物细胞中，对于在原核生物细胞中，对于 tRNA 丰富的密码子称丰富的密码子称为偏爱密码子（为偏爱密码子（ biased codons ），而对应于），而对应于 tRNA 稀少的密码子称为稀有密码子

59、（稀少的密码子称为稀有密码子（ rare codons ） 二二 表达载体中调节开关的作用表达载体中调节开关的作用 通常表达载体不应使外源基因始终处于转通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；白的过量表达必将影响细胞生长； 宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。个阶段进行。第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。

60、直至获得足够量的细胞。第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。时高效表达，产生大量有价值的表达产物。外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种不同方法。两种不同方法。化学物质诱导化学物质诱导 当用当用lac启动子构建表达载体时，启动子构建表达载体时，lac启动子受启动子受CAP蛋白和蛋白和cAMP的正调控。受阻遏蛋白的负调控；的正调控。受阻遏蛋白的负调控；当宿主细胞生长时，当宿主细胞生长时，lac I基因产生的阻遏蛋白与基因产生的阻遏蛋白与lac操纵基因操纵基因结合，阻碍外源