大三上课件食品微生物

1、第三节第三节 碳疽杆菌碳疽杆菌 碳疽杆菌属于芽孢杆菌属，本属细菌除碳疽杆菌碳疽杆菌属于芽孢杆菌属，本属细菌除碳疽杆菌是对人、畜危害严重的致病菌外，其它一般是非致病是对人、畜危害严重的致病菌外，其它一般是非致病菌。该菌主要以碳疽芽孢的形式存在于被污染的土壤、菌。该菌主要以碳疽芽孢的形式存在于被污染的土壤、畜产品及水中，常引起人畜共患的急性、热性、多取畜产品及水中，常引起人畜共患的急性、热性、多取败血性经过的传染病。本病可分为败血型和局限型两败血性经过的传染病。本病可分为败血型和局限型两类。绵羊、牛、马最易感，常取急性和亚急性败血型类。绵羊、牛、马最易感，常取急性和亚急性败血型经过。猪对本病有抵抗

2、力，表现为慢性经过。经过。猪对本病有抵抗力，表现为慢性经过。 人传染本病多为接触型，并多半表现为局限型，人传染本病多为接触型，并多半表现为局限型，分为皮肤碳疽、肠碳疽和肺碳疽。人的感染途径主要分为皮肤碳疽、肠碳疽和肺碳疽。人的感染途径主要是：屠宰工人通过破损的皮肤和外表粘膜接触感染；是：屠宰工人通过破损的皮肤和外表粘膜接触感染；病畜肉或其加工制品中带有碳疽芽孢，处理不当，食病畜肉或其加工制品中带有碳疽芽孢，处理不当，食后引起肠型碳疽；处理及运送畜产品时因吸入含碳疽后引起肠型碳疽；处理及运送畜产品时因吸入含碳疽芽孢的尘埃，发生肺碳疽。芽孢的尘埃，发生肺碳疽。 一、生物学特性一、生物学特性（一）形

3、态与染色特性（一）形态与染色特性 该菌的繁殖体为长而直的大杆菌，一般该菌的繁殖体为长而直的大杆菌，一般38um11.5um，无鞭毛，不能运动，在涂，无鞭毛，不能运动，在涂片标本中呈单在或短链状排列，杆菌的末端片标本中呈单在或短链状排列，杆菌的末端直截或稍凹陷，菌体的连接处有清晰的空隙直截或稍凹陷，菌体的连接处有清晰的空隙如竹节状，人工培养后则形成长链状。在猪如竹节状，人工培养后则形成长链状。在猪体内的杆菌，往往可见到许多变异形态，如体内的杆菌，往往可见到许多变异形态，如分节不清，菌体呈扭转或卷曲状，菌体粗细分节不清，菌体呈扭转或卷曲状，菌体粗细不等，荚膜很厚，镜检时所见细菌很粗大等。不等，荚膜

4、很厚，镜检时所见细菌很粗大等。 一般苯胺染料都易着色，革兰氏染色阳性，一般苯胺染料都易着色，革兰氏染色阳性，但在旧的培养物中有时呈阴性。该菌在畜体可但在旧的培养物中有时呈阴性。该菌在畜体可形成荚膜，它与致病力有密切关系。在动物体形成荚膜，它与致病力有密切关系。在动物体外，用加血清的培养基在含有外，用加血清的培养基在含有1020CO2环境环境中培养也可形成荚膜。荚膜对腐败的抵抗力较中培养也可形成荚膜。荚膜对腐败的抵抗力较菌体强，用腐败的病理材料制片时，往往可见菌体强，用腐败的病理材料制片时，往往可见到没有菌体的空荚膜，称之为到没有菌体的空荚膜，称之为“菌影菌影”。荚膜。荚膜最好用姬姆萨氏染色法染

5、色观察。最好用姬姆萨氏染色法染色观察。炭疽杆菌炭疽杆菌扫描电镜照片炭疽杆菌链状排列炭疽芽孢 本菌在动物体外可形成芽孢，一般认为其本菌在动物体外可形成芽孢，一般认为其芽孢须在有氧条件和适宜的温度下形成（芽孢须在有氧条件和适宜的温度下形成（2530），为卵圆形，位于菌体中央，不超过菌），为卵圆形，位于菌体中央，不超过菌体横径。其芽孢折光性强，一般染色法不易着体横径。其芽孢折光性强，一般染色法不易着色。芽孢成熟后可从菌体脱出，故在陈旧的培色。芽孢成熟后可从菌体脱出，故在陈旧的培养物中有时仅能看见芽孢；芽孢对不良环境有养物中有时仅能看见芽孢；芽孢对不良环境有强大的抵抗力，一旦遇到适宜条件，又可重新强大

6、的抵抗力，一旦遇到适宜条件，又可重新发芽，发育成繁殖体恢复致病力。发芽，发育成繁殖体恢复致病力。（二）培养与生化特性（二）培养与生化特性 本菌为需氧菌，生长最适温度本菌为需氧菌，生长最适温度37，pH7.27.6，对营养要求不严格，在一般培养，对营养要求不严格，在一般培养基上即可生长。基上即可生长。在普通（营养）琼脂上，在普通（营养）琼脂上，1824h可形成直径可形成直径23mm、扁平、粗糙、灰白色、扁平、粗糙、灰白色、不透明、边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜不透明、边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察，菌落呈卷发状。观察，菌落呈卷发状。在血液琼脂平板上，该在血液琼脂平板上，该菌不溶血（或轻度

7、溶血），这是碳疽杆菌和与菌不溶血（或轻度溶血），这是碳疽杆菌和与其相类似的细菌的区别之一。其相类似的细菌的区别之一。 在普通肉汤中，培养在普通肉汤中，培养1824h，细菌菌落，细菌菌落长成乳白色疏松的絮状菌丝沉于管底或悬浮长成乳白色疏松的絮状菌丝沉于管底或悬浮于肉汤中，培养基不浑浊，仍保持透明状态，于肉汤中，培养基不浑浊，仍保持透明状态，振荡试管絮状物迅速上升，菌丝不易摇碎，振荡试管絮状物迅速上升，菌丝不易摇碎，不形成菌膜。染色镜检时，可见长丝状菌链。不形成菌膜。染色镜检时，可见长丝状菌链。明胶穿刺培养时，除沿穿刺线生长外，并向明胶穿刺培养时，除沿穿刺线生长外，并向四周呈直放射状生长，愈向下愈

8、短，因此长四周呈直放射状生长，愈向下愈短，因此长期的培养物呈现白色并带有分枝的棉絮样，期的培养物呈现白色并带有分枝的棉絮样，好象倒立的杉树状。培养好象倒立的杉树状。培养23天后，其表面往天后，其表面往往液化成漏斗状。往液化成漏斗状。 在固体或液体培养基中每毫升加入在固体或液体培养基中每毫升加入0.050.5单位的青霉素单位的青霉素G，能使菌体形成串珠状，称，能使菌体形成串珠状，称此为此为“串珠实验串珠实验”。这是本菌特有的反应，常。这是本菌特有的反应，常用来与碳疽杆菌类似的需氧芽孢杆菌鉴别。用来与碳疽杆菌类似的需氧芽孢杆菌鉴别。 碳疽杆菌能分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、碳疽杆菌能分解葡萄糖、蔗糖、

9、麦芽糖、菊糖、果糖、淀粉和甘油，个别菌株能分解甘菊糖、果糖、淀粉和甘油，个别菌株能分解甘露醇，产酸不产气。不分解乳糖与水杨苷。不露醇，产酸不产气。不分解乳糖与水杨苷。不产生靛基质与硫化氢。产生靛基质与硫化氢。V-P试验不定。不能利试验不定。不能利用尿素。能还原硝酸盐为亚硝酸盐。在牛乳中用尿素。能还原硝酸盐为亚硝酸盐。在牛乳中生长，生长，24d后凝固，然后缓慢胨化。后凝固，然后缓慢胨化。 （三）致病性与毒力因素（三）致病性与毒力因素 碳疽杆菌主要引起草食动物发病，以绵羊、碳疽杆菌主要引起草食动物发病，以绵羊、牛、马、鹿等最易感，猪、山羊较差，禽类一牛、马、鹿等最易感，猪、山羊较差，禽类一般不感染

10、。人对碳疽的易感性仅次于牛羊。实般不感染。人对碳疽的易感性仅次于牛羊。实验动物中小鼠、豚鼠、家兔对本菌都非常敏感。验动物中小鼠、豚鼠、家兔对本菌都非常敏感。 碳疽菌的致病因素主要有荚膜与毒素两类碳疽菌的致病因素主要有荚膜与毒素两类成分。荚膜物质能抑制抗体的作用，可抗吞噬成分。荚膜物质能抑制抗体的作用，可抗吞噬细胞的吞噬作用，使细菌易于向外扩散繁殖。细胞的吞噬作用，使细菌易于向外扩散繁殖。碳疽毒素菌毒素可增加微血管的通透性，影响碳疽毒素菌毒素可增加微血管的通透性，影响血液循环的正常进行，损害肾脏功能，干扰糖血液循环的正常进行，损害肾脏功能，干扰糖代谢，最后导致动物死亡。代谢，最后导致动物死亡。碳

11、疽毒素由三种成分构成：碳疽毒素由三种成分构成： 1.保护性抗原（保护性抗原（PA） 为蛋白质，具有抗吞噬作用和免疫原性，存在于死为蛋白质，具有抗吞噬作用和免疫原性，存在于死后不久的动物水肿液中，可保护豚鼠的抗碳疽感染。后不久的动物水肿液中，可保护豚鼠的抗碳疽感染。 2.致死因子（致死因子（LF） 也是蛋白质，具抗原性，单独无生物学活性。也是蛋白质，具抗原性，单独无生物学活性。 3.水肿因子（水肿因子（EF） 为脂蛋白，具抗原性，在毒性复合物中起作用，能为脂蛋白，具抗原性，在毒性复合物中起作用，能抑制豚鼠白细胞吞噬作用，单独无生物学活性。抑制豚鼠白细胞吞噬作用，单独无生物学活性。 以上三种成分单

12、独对动物均无毒性表现，至少有两以上三种成分单独对动物均无毒性表现，至少有两种以上成分才能引起动物发病。种以上成分才能引起动物发病。 （四）抗原构造（四）抗原构造 碳疽杆菌具有三种主要抗原成分，即荚碳疽杆菌具有三种主要抗原成分，即荚膜抗原、菌体抗原和保护性抗原。膜抗原、菌体抗原和保护性抗原。 1.荚膜抗原荚膜抗原 是一种半抗原，由是一种半抗原，由a谷氨酸多肽组成，谷氨酸多肽组成，是碳疽的重要毒力成分，在动物体内能抵抗是碳疽的重要毒力成分，在动物体内能抵抗吞噬作用。荚膜抗原所产生的抗体，对肌体吞噬作用。荚膜抗原所产生的抗体，对肌体无保护性作用。无保护性作用。2.菌体抗原菌体抗原 系由乙酸氨基葡萄糖

13、和半乳糖所组成的系由乙酸氨基葡萄糖和半乳糖所组成的一种多糖，也是一种半抗原。有特异性，但一种多糖，也是一种半抗原。有特异性，但与毒力无关。具有耐热性，经受住消毒、煮与毒力无关。具有耐热性，经受住消毒、煮沸、甚至高压蒸汽处理，处理后抗原也不被沸、甚至高压蒸汽处理，处理后抗原也不被破坏。仍可与特异性免疫血清发生沉淀反应。破坏。仍可与特异性免疫血清发生沉淀反应。3.保护性抗原保护性抗原 是碳疽在生活过程中产生的一种细胞外成是碳疽在生活过程中产生的一种细胞外成分，是一种蛋白质或蛋白质与其它物质相结合分，是一种蛋白质或蛋白质与其它物质相结合的复合物，为碳疽杆菌毒素的重要组成成分，的复合物，为碳疽杆菌毒素

14、的重要组成成分，具有免疫原性，能保护真菌的感染。具有免疫原性，能保护真菌的感染。 （五）抵抗力（五）抵抗力 碳疽杆菌繁殖体的抵抗力与一般非芽孢杆菌大碳疽杆菌繁殖体的抵抗力与一般非芽孢杆菌大致相同，致相同，60经经3060分钟，分钟，75515分钟即可被杀分钟即可被杀死。常用消毒药在一般浓度下，短时间内即可使之死。常用消毒药在一般浓度下，短时间内即可使之死亡，青霉素对其有很强的抑制作用。死亡，青霉素对其有很强的抑制作用。 碳疽杆菌的芽孢具有较强大的抵抗力碳疽杆菌的芽孢具有较强大的抵抗力。在土壤。在土壤中的芽孢，其传染性可保持数十年，在皮毛上可存中的芽孢，其传染性可保持数十年，在皮毛上可存活数年。

15、煮沸十五分钟可杀死多数芽孢，活数年。煮沸十五分钟可杀死多数芽孢，160干热干热2小时，小时，121高压灭菌高压灭菌510分钟，分钟，115高压灭菌高压灭菌515分钟，流通蒸汽分钟，流通蒸汽3060分钟均可杀死全部芽孢。对分钟均可杀死全部芽孢。对低温有一定的抵抗力，低温有一定的抵抗力，5至至10冰冻状态可活冰冻状态可活4年，年，在在190浓氧环境中芽孢仍能保持生活能力。浓氧环境中芽孢仍能保持生活能力。 芽孢对各种消毒药物的抵抗能力是不同的。芽孢对各种消毒药物的抵抗能力是不同的。对碘特别敏感，对碘特别敏感，1:2500碘液碘液10分钟即可杀死芽分钟即可杀死芽孢；孢；0.1升汞液加升汞液加0.5盐酸

16、可于盐酸可于15分钟杀分钟杀灭碳疽芽孢；灭碳疽芽孢；1020漂白粉溶液、漂白粉溶液、10热热氢氧化钠溶液是较常用的消毒剂；环氧乙烷对氢氧化钠溶液是较常用的消毒剂；环氧乙烷对碳疽芽孢有很好的杀灭作用，可作为怀疑染有碳疽芽孢有很好的杀灭作用，可作为怀疑染有该菌的兽皮或毛及其制品的消毒剂。该菌的兽皮或毛及其制品的消毒剂。 二、检验技术二、检验技术 该菌的检验是以病原体的镜检、培养特性该菌的检验是以病原体的镜检、培养特性和生物学试验为基础。由于碳疽杆菌能形成抵和生物学试验为基础。由于碳疽杆菌能形成抵抗力极强的芽孢，并可经皮肤、呼吸道和消化抗力极强的芽孢，并可经皮肤、呼吸道和消化道等途径感染于人。所以实

17、验室检验时，必须道等途径感染于人。所以实验室检验时，必须注意个人防护和安全操作。注意个人防护和安全操作。（一）采样：检样的采取要从以下几个方面着手。（一）采样：检样的采取要从以下几个方面着手。 1.患急性败血症死亡的动物，不得解体，一患急性败血症死亡的动物，不得解体，一般先将耳根部位表面消毒，割开耳根部皮肤，般先将耳根部位表面消毒，割开耳根部皮肤，采取小血管渗出的少量血液进行检验。采取小血管渗出的少量血液进行检验。 2.猪碳疽一般病灶局限于颌下、肠系膜淋巴猪碳疽一般病灶局限于颌下、肠系膜淋巴结部位最多，采集病变组织进行检验。结部位最多，采集病变组织进行检验。 3.其它，如可疑碳疽动物的羽绒、毛

18、、皮、其它，如可疑碳疽动物的羽绒、毛、皮、骨或皮革厂的洗皮污水等。骨或皮革厂的洗皮污水等。 （二）检验程序及方法（二）检验程序及方法1.镜检镜检 以待检材料制成涂片，荚膜染色或革兰氏以待检材料制成涂片，荚膜染色或革兰氏染色后进行镜检。观察有无典型碳疽杆菌及荚染色后进行镜检。观察有无典型碳疽杆菌及荚膜。并结合临床症状，提出初步诊断。注意猪膜。并结合临床症状，提出初步诊断。注意猪及人皮肤碳疽的细菌形态往往极不一致，有的及人皮肤碳疽的细菌形态往往极不一致，有的呈呈S形、形、J形、形、O形或成堆排列，有的有荚膜，形或成堆排列，有的有荚膜，有的无荚膜，有的荚膜极厚。常可见到有的无荚膜，有的荚膜极厚。常可

19、见到“菌影菌影”及菌体碎片。革兰氏染色也不正常。最后确诊及菌体碎片。革兰氏染色也不正常。最后确诊还要靠培养鉴定。还要靠培养鉴定。 2.分离培养分离培养 （1）因败血型碳疽死亡的动物，用白金耳蘸取切）因败血型碳疽死亡的动物，用白金耳蘸取切开耳根皮肤渗出的血液少许，接种在血液琼脂平板上。开耳根皮肤渗出的血液少许，接种在血液琼脂平板上。如为猪的局限性碳疽，则取局部病变组织，外表用烧如为猪的局限性碳疽，则取局部病变组织，外表用烧烙法消毒后，剪出断面，用断面印压在血琼脂平板或烙法消毒后，剪出断面，用断面印压在血琼脂平板或选择性平板上，再用白金耳划线培养。选择性平板上，再用白金耳划线培养。 （2）其他可疑

20、含碳疽芽孢的材料先行处理，将检）其他可疑含碳疽芽孢的材料先行处理，将检样放在灭菌试管或三角瓶内，加适量无菌生理盐水，样放在灭菌试管或三角瓶内，加适量无菌生理盐水，振荡振荡12分钟，加热分钟，加热6030分钟或分钟或8010分钟，杀死分钟，杀死杂菌，再接种于血琼脂平板上，用曲玻棒将检样涂匀。杂菌，再接种于血琼脂平板上，用曲玻棒将检样涂匀。接种后平板经接种后平板经37培养培养1824小时，进一步做菌落观小时，进一步做菌落观察，挑选可疑菌落进行其他鉴别试验。察，挑选可疑菌落进行其他鉴别试验。3.动物试验动物试验 取待检菌取待检菌371824小时肉汤培养物小时肉汤培养物0.1ml，接种于小鼠皮下，一般

21、在接种后的接种于小鼠皮下，一般在接种后的2496小时，小时，实验动物发病死亡，剖检时在接种部位皮下可实验动物发病死亡，剖检时在接种部位皮下可见有严重的胶样浸润，然后取小鼠的心血或脾见有严重的胶样浸润，然后取小鼠的心血或脾脏进行涂片染色镜检，并接种血液琼脂平板证脏进行涂片染色镜检，并接种血液琼脂平板证实。实。 4.鉴别试验鉴别试验 鉴别试验有噬菌体裂解试验、串珠试验、动力试鉴别试验有噬菌体裂解试验、串珠试验、动力试验等。因串珠试验前面已经提及，这里重点介绍：验等。因串珠试验前面已经提及，这里重点介绍： （1）噬菌体裂解试验）噬菌体裂解试验 碳疽噬菌体对碳疽杆菌有较高的特异性，可作为碳疽噬菌体对碳

22、疽杆菌有较高的特异性，可作为鉴别碳疽杆菌的重要依据。实验方法是，将待检的肉鉴别碳疽杆菌的重要依据。实验方法是，将待检的肉汤培养物，用白金耳密集地涂于普通琼脂平板上，待汤培养物，用白金耳密集地涂于普通琼脂平板上，待干后，在涂菌中央部滴加干后，在涂菌中央部滴加10-610-8倍的碳疽杆菌噬菌倍的碳疽杆菌噬菌体稀释液，经体稀释液，经371824小时培养，观察有无噬菌斑，小时培养，观察有无噬菌斑，有者为碳疽杆菌，非碳疽杆菌则无噬菌斑。有者为碳疽杆菌，非碳疽杆菌则无噬菌斑。（2）动力试验）动力试验 用白金针蘸取可疑菌落，穿刺接种在半固用白金针蘸取可疑菌落，穿刺接种在半固体培养基中体培养基中37 培养培养

23、824小时，观察结果。碳小时，观察结果。碳疽杆菌沿穿刺线生长，无动力，而绝大多数杆疽杆菌沿穿刺线生长，无动力，而绝大多数杆菌有动力。其它方法如明胶液化试验、菌有动力。其它方法如明胶液化试验、Ascoli氏沉淀反应等也可用于鉴定此菌。氏沉淀反应等也可用于鉴定此菌。5.快速检验方法快速检验方法 （1）荚膜荧光抗体染色）荚膜荧光抗体染色 涂片用火焰固定，再用涂片用火焰固定，再用10中性福尔马林中性福尔马林液浸泡液浸泡1015分钟，水洗，然后向涂片上滴加分钟，水洗，然后向涂片上滴加碳疽荚膜荧光血清，置碳疽荚膜荧光血清，置37湿箱中染色湿箱中染色30分钟，分钟，倾去染色液，用倾去染色液，用pH8.0缓冲

24、液浸泡缓冲液浸泡3分钟，用蒸分钟，用蒸馏水轻轻冲洗，晾干，镜检。若在不着色的粗馏水轻轻冲洗，晾干，镜检。若在不着色的粗大菌体周围看到发亮黄绿色荧光时，即为阳性。大菌体周围看到发亮黄绿色荧光时，即为阳性。 （2）串珠荧光抗体染色法）串珠荧光抗体染色法 这是结合串珠法和荧光抗体法而设计的一种方法，这是结合串珠法和荧光抗体法而设计的一种方法，它具有双重的特异性，大大地提高了对碳疽杆菌鉴定它具有双重的特异性，大大地提高了对碳疽杆菌鉴定的使用价值。的使用价值。 检查时，取串珠肉汤培养物一白金耳滴于先涂有检查时，取串珠肉汤培养物一白金耳滴于先涂有薄层甘油蛋白的载玻片上，置薄层甘油蛋白的载玻片上，置37湿热

25、箱中烘干，再湿热箱中烘干，再放入无水酒精中浸泡放入无水酒精中浸泡15分钟（以使甘油蛋白固定于子分钟（以使甘油蛋白固定于子出玻片上，防止被检物因染色洗涤而脱落）取出后放出玻片上，防止被检物因染色洗涤而脱落）取出后放入入37温箱中烘干，向涂片处滴加碳疽荧光血清，放温箱中烘干，向涂片处滴加碳疽荧光血清，放在湿盒中，在在湿盒中，在37下染色下染色10分钟，倾去荧光血清，在分钟，倾去荧光血清，在pH8.0缓冲液中浸泡缓冲液中浸泡10分钟，再用蒸馏水洗、干燥、分钟，再用蒸馏水洗、干燥、镜检。如看到具有明亮黄绿色荧光的典型串珠，即为镜检。如看到具有明亮黄绿色荧光的典型串珠，即为阳性。阳性。 （3）碳血清凝集

26、反应）碳血清凝集反应 a.碳血清制备：取碳血清制备：取1.0克湿碳粉放于沉淀管中，克湿碳粉放于沉淀管中，加入用加入用pH6.4PBS稀释稀释2040倍的免疫血清倍的免疫血清12ml，混合均匀后，在混合均匀后，在37作用作用60分钟，使其吸附致分钟，使其吸附致敏。期间每敏。期间每1520分钟摇动一次，然后以分钟摇动一次，然后以3000转转/分离心分离心10分钟，弃上清液，这样反复洗涤二次，分钟，弃上清液，这样反复洗涤二次，再向沉淀物中加入再向沉淀物中加入1兔血清、兔血清、0.5硼酸硼酸PBS 12ml及及1硫柳汞硫柳汞0.12ml，混匀后即为碳血清。，混匀后即为碳血清。另取正常兔血清，如上法制备

27、正常的碳血清以另取正常兔血清，如上法制备正常的碳血清以供对照。供对照。b.方法：取玻璃板一块，用方法：取玻璃板一块，用1ml吸管取待检菌吸管取待检菌液向玻璃板上滴二滴，每滴液向玻璃板上滴二滴，每滴0.1ml，再往上述，再往上述菌液中分别滴加碳疽碳血清各菌液中分别滴加碳疽碳血清各0.05ml，混匀，混匀后，置室温下后，置室温下5分钟，观察结果。分钟，观察结果。 凡检验液滴中出现碳粉颗粒状凝集，液凡检验液滴中出现碳粉颗粒状凝集，液滴透明，即为阳性。滴透明，即为阳性。 第四节第四节 链球菌链球菌 链球菌是指一大类呈链状排列的球菌，称为链球链球菌是指一大类呈链状排列的球菌，称为链球菌属。本菌广泛分布在

28、自然界，一般存在于水、乳、菌属。本菌广泛分布在自然界，一般存在于水、乳、粪便以及人和动物的病灶内。健康人和动物的皮肤和粪便以及人和动物的病灶内。健康人和动物的皮肤和粘膜上，呼吸道和消化道内往往带菌。粘膜上，呼吸道和消化道内往往带菌。 链球菌的种类很多，引起畜禽和人的疾病各异，链球菌的种类很多，引起畜禽和人的疾病各异，主要为化脓性病症，在家畜引起马的腺疫、牛的乳房主要为化脓性病症，在家畜引起马的腺疫、牛的乳房炎、猪和毛皮动物的链球菌病，在人可引起猩红热、炎、猪和毛皮动物的链球菌病，在人可引起猩红热、扁桃体炎及食物中毒等。因此，链球菌的检验工作不扁桃体炎及食物中毒等。因此，链球菌的检验工作不仅在临

29、床和流行病学上有重要意义，在食品卫生工作仅在临床和流行病学上有重要意义，在食品卫生工作中也有十分重要的意义。中也有十分重要的意义。 近年来由本菌引起的食物中毒已为人们所近年来由本菌引起的食物中毒已为人们所注意。在可疑为链球菌引起的食物中毒爆发时，注意。在可疑为链球菌引起的食物中毒爆发时，应通过检验证实该菌与食品中毒的关系。链球应通过检验证实该菌与食品中毒的关系。链球菌性食物中毒，经常由乳、肉类食品所引起，菌性食物中毒，经常由乳、肉类食品所引起，多系多系溶血链球菌。溶血链球菌。溶血型链球菌引起食物中溶血型链球菌引起食物中毒很少。就血清群而言，引起食物中毒的主要毒很少。就血清群而言，引起食物中毒的

30、主要为为B、D、H三群，其中以三群，其中以D群最为常见。群最为常见。一、生物学特性一、生物学特性 （一）形态与染色特性（一）形态与染色特性 本菌为圆形或卵圆形，直径本菌为圆形或卵圆形，直径0.51.0um,常呈链状排常呈链状排列，链的长短不一，一般长链为致病性强，非致病性或列，链的长短不一，一般长链为致病性强，非致病性或毒力较弱的菌株链较短。在液体培养基中易呈长链，在毒力较弱的菌株链较短。在液体培养基中易呈长链，在固体培养基上常呈短链。固体培养基上常呈短链。 一般链球菌无鞭毛，不能运动，也无芽孢，但一般链球菌无鞭毛，不能运动，也无芽孢，但D群群和和N群中某些菌株具有鞭毛。多数菌株在血清肉汤幼龄

31、群中某些菌株具有鞭毛。多数菌株在血清肉汤幼龄培养物（培养物（24小时），可形成透明质酸成分的荚膜，继小时），可形成透明质酸成分的荚膜，继续培养荚膜消失。续培养荚膜消失。 链球菌易被一般苯胺染料着色，自病灶部分离的菌链球菌易被一般苯胺染料着色，自病灶部分离的菌株为革兰氏阳性，但若长时间培养后可变为阴性。株为革兰氏阳性，但若长时间培养后可变为阴性。链球菌扫描电镜照片（二）培养和生化特性（二）培养和生化特性 本菌为需氧菌或兼性厌氧菌。最适生长温度为本菌为需氧菌或兼性厌氧菌。最适生长温度为37，最适，最适pH为为7.47.6。多数致病性菌株的营养要。多数致病性菌株的营养要求较高，在普通培养基上生长不良

32、，必须加血液、血求较高，在普通培养基上生长不良，必须加血液、血清、腹水等，如在培养基中加入清、腹水等，如在培养基中加入0.5葡萄糖则细菌生葡萄糖则细菌生长更佳。长更佳。 血琼脂平板：血琼脂平板：37经经1824小时，形成灰白色、小时，形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.50.7mm的小菌落。由于菌株不同，在其菌落周围可有的小菌落。由于菌株不同，在其菌落周围可有不同的溶血现象发生。不同的溶血现象发生。 血清肉汤：一般呈颗粒状生长，大多沉于管底。血清肉汤：一般呈颗粒状生长，大多沉于管底。溶血性的长链菌株呈颗粒状或絮状沉淀，培养基透亮。溶血

33、性的长链菌株呈颗粒状或絮状沉淀，培养基透亮。不溶血菌株链较短，或只呈双球菌，中期呈均匀浑浊。不溶血菌株链较短，或只呈双球菌，中期呈均匀浑浊。 本菌分解葡萄糖后产生乳酸、少量甲酸、醋酸本菌分解葡萄糖后产生乳酸、少量甲酸、醋酸和乙醇。对乳糖、甘露醇、水杨苷、蕈糖的发酵能和乙醇。对乳糖、甘露醇、水杨苷、蕈糖的发酵能力因菌株的不同而异。如肠链球球菌大多数可分解力因菌株的不同而异。如肠链球球菌大多数可分解甘露醇，人类溶血性链球菌常可分解蕈糖，不分解甘露醇，人类溶血性链球菌常可分解蕈糖，不分解蔷薇醇，但动物溶血性链球菌可分解蔷薇醇而不分蔷薇醇，但动物溶血性链球菌可分解蔷薇醇而不分解蕈糖。链球菌一般不分解菊

34、糖（某些草绿色菌株解蕈糖。链球菌一般不分解菊糖（某些草绿色菌株例外），不被胆汁或例外），不被胆汁或10胆盐所分解，这两点可用胆盐所分解，这两点可用来鉴别链球菌和肺炎双球菌。来鉴别链球菌和肺炎双球菌。 肠链球菌可在肠链球菌可在6.5氯化钠葡萄糖肉汤、氯化钠葡萄糖肉汤、40胆胆汁肉汤、汁肉汤、pH9.6的葡萄糖肉汤和的葡萄糖肉汤和0.1美蓝牛乳培养美蓝牛乳培养基中生长，能在基中生长，能在10和和45生长，这几点可作为肠生长，这几点可作为肠链球菌和其它链球菌的鉴别试验。链球菌和其它链球菌的鉴别试验。 （三）链球菌的分类（三）链球菌的分类 1.根据溶血能力不同分类：根据该属细菌在根据溶血能力不同分类：

35、根据该属细菌在血琼脂上的溶血作用不同分为三型：血琼脂上的溶血作用不同分为三型： 甲型链球菌（甲型链球菌（型）型）在菌落周围形成不透在菌落周围形成不透明的绿色圈；明的绿色圈； 乙型链球菌（乙型链球菌（型）型）在菌落周围形成无色在菌落周围形成无色透明的完全溶血圈；透明的完全溶血圈； 丙型链球菌（丙型链球菌（型）型）在血琼脂表面的菌落在血琼脂表面的菌落周围无溶血圈周围无溶血圈。 2.根据抗原结构分：链球菌的细胞壁中含有一群特异根据抗原结构分：链球菌的细胞壁中含有一群特异性抗原，它是多糖类半抗原，成为：性抗原，它是多糖类半抗原，成为：“C”物质。物质。20世世纪纪 3 0 年 代 ， 应 用 这 种

36、抗 原 ， 根 据 兰 西 菲 尔 德年 代 ， 应 用 这 种 抗 原 ， 根 据 兰 西 菲 尔 德（Lancefield)血清学分类，可将链球菌分成许多群。血清学分类，可将链球菌分成许多群。目前有目前有A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U等等19个血清群（缺个血清群（缺I、J群）。群）。每个群又分若干型或亚型、现将几种较重要的血清群每个群又分若干型或亚型、现将几种较重要的血清群介绍如下：介绍如下： A群：主要对人类致病，如猩红热、扁桃腺炎、丹群：主要对人类致病，如猩红热、扁桃腺炎、丹毒以及各种炎症及败血症。对动物致病性不强，但在毒以及各种炎症及败血症

37、。对动物致病性不强，但在公共卫生上有重要性。公共卫生上有重要性。 B群：致牛乳房炎，如无乳链球菌等，对人无致病群：致牛乳房炎，如无乳链球菌等，对人无致病性。性。 C群：主要对各种动物致病，共有群：主要对各种动物致病，共有20多种，有的对人有致病性。多种，有的对人有致病性。D群：寄生于人、畜及禽类肠道中，属肠球菌的一部分，一般不群：寄生于人、畜及禽类肠道中，属肠球菌的一部分，一般不致病，偶尔可引起小猪心内膜炎及关节炎和羊心内膜炎、肝炎。致病，偶尔可引起小猪心内膜炎及关节炎和羊心内膜炎、肝炎。一般与食物中毒有关。一般与食物中毒有关。 E群：寄生于牛、猪阴道，对组织的侵入能力不强，又称猪链群：寄生于

38、牛、猪阴道，对组织的侵入能力不强，又称猪链球菌，致猪颈部淋巴节浓肿、化浓性支气管炎、脑膜炎及一部球菌，致猪颈部淋巴节浓肿、化浓性支气管炎、脑膜炎及一部分牛乳房炎。其它如分牛乳房炎。其它如G、L、M、P、R、S及及T群对猪均有不同群对猪均有不同程度的致病作用，引起猪发生败血症、脑膜炎、心内膜炎、关程度的致病作用，引起猪发生败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎及脓肿等，其中某些群对其它动物也有致病作用。此外，节炎及脓肿等，其中某些群对其它动物也有致病作用。此外，也有根据生物学性状分类（细菌对理化因素抵抗力及生化反也有根据生物学性状分类（细菌对理化因素抵抗力及生化反应）；根据对氧气需要与否分类（需氧链球

39、菌、厌氧链球菌、应）；根据对氧气需要与否分类（需氧链球菌、厌氧链球菌、兼性厌氧链球菌）等。兼性厌氧链球菌）等。 上述分类，在临床上以溶血性质分类较简便实用，以抗原构上述分类，在临床上以溶血性质分类较简便实用，以抗原构造分类特异性最高，最准确。造分类特异性最高，最准确。 （四）抗原构造（四）抗原构造 本菌抗原构造比较复杂，由于与人类疾病有关的大多数属于本菌抗原构造比较复杂，由于与人类疾病有关的大多数属于型溶血性链球菌，现主要介绍一下该型的抗原构造，可分为型溶血性链球菌，现主要介绍一下该型的抗原构造，可分为三种：三种： 1.核蛋白抗原（核蛋白抗原（P抗原）：此种抗原无种、属、群、型的特抗原）：此种

40、抗原无种、属、群、型的特异性，各种链球菌的本抗原都是一致的，和肺炎球菌、葡萄球异性，各种链球菌的本抗原都是一致的，和肺炎球菌、葡萄球菌的核蛋白有相互交叉反应。菌的核蛋白有相互交叉反应。 2.群特异性抗原（群特异性抗原（C抗原）是细胞壁的多糖成分，有群特异抗原）是细胞壁的多糖成分，有群特异性。据此，可将链球菌分成性。据此，可将链球菌分成9个血清群。个血清群。 3.型特异性抗原（表面抗原）是链球菌细胞壁的蛋白抗原，型特异性抗原（表面抗原）是链球菌细胞壁的蛋白抗原，位于位于C抗原的外层，其中又分为抗原的外层，其中又分为M、T、R、S等四种不同性质等四种不同性质的抗原成分，与致病性有关的是的抗原成分，

41、与致病性有关的是M抗原。抗原。M抗原主要见于抗原主要见于A群群链球菌，根据链球菌，根据M抗原的不同，可用血清学反应将抗原的不同，可用血清学反应将A群链球菌分群链球菌分成成60多个型。多个型。 （五）致病性与毒力因素（五）致病性与毒力因素 链球菌的种类繁多，分布广，能引起畜禽多种链球菌的种类繁多，分布广，能引起畜禽多种不同的疾病，除前面已经提及的之外，还能引起多不同的疾病，除前面已经提及的之外，还能引起多种化脓性炎症、呼吸道感染，如气管炎、咽喉炎、种化脓性炎症、呼吸道感染，如气管炎、咽喉炎、肺炎等，并且还是食物污染的重要原因，引起人的肺炎等，并且还是食物污染的重要原因，引起人的食物中毒。所以它不

42、仅在临床和流行病学上有重要食物中毒。所以它不仅在临床和流行病学上有重要意义，而且由于近年来它引起的食物中毒，在食品意义，而且由于近年来它引起的食物中毒，在食品卫生方面已引起人们极大关注。卫生方面已引起人们极大关注。 链球菌的致病作用除能产生各种毒素和侵袭性酶链球菌的致病作用除能产生各种毒素和侵袭性酶类外，菌体本身的一些成分，在致病过程中也起重类外，菌体本身的一些成分，在致病过程中也起重要作用。如菌体外的荚膜，链球菌表面的要作用。如菌体外的荚膜，链球菌表面的M抗原，抗原，均具有抗吞噬作用，是细菌侵袭力的组成部分均具有抗吞噬作用，是细菌侵袭力的组成部分 。 致病性链球菌能产生多种酶和外毒素。致病性

43、链球菌能产生多种酶和外毒素。例如透明质酸酶（又称扩散因子）、链激酶例如透明质酸酶（又称扩散因子）、链激酶（又称为纤维蛋白酶）、链道酶（又称脱氧（又称为纤维蛋白酶）、链道酶（又称脱氧核糖核酸酶）、蛋白酶、溶血毒素、溶血素、核糖核酸酶）、蛋白酶、溶血毒素、溶血素、红疹毒素等，均是本菌具有致性能的主要毒红疹毒素等，均是本菌具有致性能的主要毒力因素。力因素。（六）抵抗力（六）抵抗力 本菌抵抗力不强本菌抵抗力不强6030分钟即可死亡。分钟即可死亡。巴氏杀菌巴氏杀菌6063经经30分钟可将牛乳中的致分钟可将牛乳中的致病性链球菌杀死。对磺胺、青霉素等广谱抗病性链球菌杀死。对磺胺、青霉素等广谱抗菌素均敏感。菌

44、素均敏感。 二、检验技术二、检验技术 由于与人类疾病有关的大多数属于由于与人类疾病有关的大多数属于型溶型溶血性链球菌，其血清型血性链球菌，其血清型90属于属于A群链球菌，群链球菌，它除了常能引起化浓性炎症及呼吸道感染外，它除了常能引起化浓性炎症及呼吸道感染外，还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发流行，所以检验工作显得更为重要。流行，所以检验工作显得更为重要。（一）细菌学检验（一）细菌学检验 1.检样处理：称取检样处理：称取25克固体检验，加入克固体检验，加入225ml灭菌生灭菌生理盐水，研成匀浆制成悬浮液，液体检样可直接培理盐水，研成匀浆制成悬浮液，

45、液体检样可直接培养。养。 2.一般培养：将上述混悬液或液体检样直接划线于一般培养：将上述混悬液或液体检样直接划线于血平板，并吸取血平板，并吸取5ml接种于接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤内。葡萄糖肉浸液肉汤内。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经经361培养培养24小时，接种血平板，置小时，接种血平板，置361培培养养24小时，挑取小时，挑取型溶血圆形凸起的细小菌落，在血型溶血圆形凸起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌敏感试验。进行链激酶试验及杆菌敏

46、感试验。 3.形态与染色培养特性：前已提及，这里不再重述。形态与染色培养特性：前已提及，这里不再重述。 4.链激酶试验：致病性溶血性链球菌能产生链激酶链激酶试验：致病性溶血性链球菌能产生链激酶（即溶血纤维蛋白酶）此酶能激活正常人体血液中（即溶血纤维蛋白酶）此酶能激活正常人体血液中血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶纤维蛋白血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶纤维蛋白酶溶解血浆。吸取草酸钾血浆酶溶解血浆。吸取草酸钾血浆0.2ml（草酸钾（草酸钾0.01克，克，加入加入5ml人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为血浆）人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为血浆）加入加入0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入

47、灭菌生理盐水，混匀，再加入1824小时小时链球菌肉汤培养物链球菌肉汤培养物0.5ml及及0.25氯化钙氯化钙0.25ml，振荡，振荡摇匀。置摇匀。置361水浴中，每隔数分钟观察一次（一水浴中，每隔数分钟观察一次（一般约般约10分钟即可凝固），血浆凝固后，再注意观察分钟即可凝固），血浆凝固后，再注意观察及记录溶化的时间。溶化时间越短，说明该菌产生及记录溶化的时间。溶化时间越短，说明该菌产生的链激酶越多。含量多时，的链激酶越多。含量多时，20分钟内凝固的血浆即分钟内凝固的血浆即完全溶解。若无变化，应在水浴持续放置完全溶解。若无变化，应在水浴持续放置2小时，然小时，然后于后于37 24小时后观察，如

48、凝块全部溶解为阳性，小时后观察，如凝块全部溶解为阳性，若仍不溶解则为阴性。若仍不溶解则为阴性。 5.杆菌肽敏感试验：挑取杆菌肽敏感试验：挑取型溶血链球菌浓菌型溶血链球菌浓菌液，涂于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含液，涂于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于于361培养培养1824小时，如有抑菌带出现小时，如有抑菌带出现即为阳性，可初步鉴定为即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌，同时群链球菌，同时用已知阳性菌作对照。用已知阳性菌作对照。 （二）血清学试验（二）血清学试验 1.分群鉴定：将分离出的菌株，经纯培养热盐酸法分群鉴定：

49、将分离出的菌株，经纯培养热盐酸法提取链球菌的提取链球菌的C多糖体作为群抗原，与群抗血清作沉多糖体作为群抗原，与群抗血清作沉淀反应，即为分群鉴定。淀反应，即为分群鉴定。 （1）多糖体群抗原制备法：将链球菌接种于）多糖体群抗原制备法：将链球菌接种于5兔兔和羊血清肉汤试管（约和羊血清肉汤试管（约5ml）内，于）内，于37培养培养6小时，小时，再移种于再移种于100ml0.2葡萄糖肉汤，培养葡萄糖肉汤，培养24小时，然后小时，然后离心沉淀，将沉淀物用生理盐水洗涤两次，然后悬于离心沉淀，将沉淀物用生理盐水洗涤两次，然后悬于0.05N盐酸溶液内，放沸水中盐酸溶液内，放沸水中15分钟取出，离心沉淀，分钟取出

50、，离心沉淀，吸取上清液，向上清液中加入溴麝香草酚兰指示剂吸取上清液，向上清液中加入溴麝香草酚兰指示剂1滴，并用滴，并用0.2N氢氧化钠中和，使溶液由黄变成绿色。氢氧化钠中和，使溶液由黄变成绿色。如在中和时出现沉淀，须用离心法除去，此上清液即如在中和时出现沉淀，须用离心法除去，此上清液即为为C多糖体群抗原。多糖体群抗原。(2)沉淀反应：此反应在内径沉淀反应：此反应在内径34mm的小试管的小试管内进行。先分别将群抗血清注入小管内，再沿内进行。先分别将群抗血清注入小管内，再沿管壁徐徐注入盐酸提取物，（此抗原可用盐水管壁徐徐注入盐酸提取物，（此抗原可用盐水稀释为：稀释为：1:10、1:20、1:40、1:80、1:160），），在重层后在重层后1520分钟，观察反应结果。如为阳分钟，观察反应结果。如为阳性时，则在液面出现明显的白色环。否则即为性时，则在液面出现明显的白色环。否则即为阴性。阴性。2.分型