遗传学幻灯12学习教案

1、会计学1第一页，共53页。第一节第一节 基因工程概述基因工程概述 遗传工程广义：细胞工程遗传工程广义：细胞工程、染色体工程、染色体工程 细胞器工细胞器工程、基因工程程、基因工程 酶工程、酶工程、发酵工程发酵工程 狭义：基因工程狭义：基因工程 基因工程概述基因工程概述 基因工程是基因工程是2020世纪世纪7070年代年代初随着初随着DNADNA重组重组(zhn z)(zhn z)技术的发展应运而生的一技术的发展应运而生的一门新技术。门新技术。 第1页/共53页第二页，共53页。1982年经美国(mi u)食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工

2、程产品直接造福于人类的首例 1985年转基因植物获得成功1996年克隆羊诞生。现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 第2页/共53页第三页，共53页。基因工程的基本步骤：基因工程的基本步骤：1. 1. 目的基因的分离或合成目的基因的分离或合成2. 2. 将目的基因与载体将目的基因与载体DNADNA连接，构建连接，构建重重 组组DNADNA分子分子- -表达载体表达载体3. 3. 将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞，并分子导入受体细胞，并获获 得具有得具有(jyu)(jyu)外源基因的个体外源基因的个体4. 4. 转基因生物的

3、检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定5. 5. 转基因生物的安全性评价转基因生物的安全性评价 第3页/共53页第四页，共53页。第二节第二节 基因的分离基因的分离基因分离（克隆）包括基因分离（克隆）包括3 3个步骤个步骤(bzhu)(bzhu)：1. 1. 目标目标DNADNA片段（基因）片段（基因）的分离的分离2. 2. 目标基因克隆到载体目标基因克隆到载体上上3. 3. 载体导入宿主细胞并载体导入宿主细胞并在其中在其中 大量复制大量复制 第4页/共53页第五页，共53页。一、工具酶一、工具酶1 1、限制性内切核酸酶、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序限制酶：作用于特定（异）核苷

4、酸序 列的磷酸二脂酶列的磷酸二脂酶型酶：仅型酶：仅EcoBEcoB和和EcoKEcoK两种，催化限制两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸性切割和修饰核苷酸2 2种功能种功能型酶：基因工程型酶：基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)中中应用最广泛应用最广泛 型酶：具有特异的识别位点，识别位型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的点是非对称的 第5页/共53页第六页，共53页。型限制性酶的基本特性：型限制性酶的基本特性： 有特异识别和切割的序列部位有特异识别和切割的序列部位(bwi)(bwi) DNA DNA分子上两个单链断裂的部位分子上两个单链断裂的部位(bwi)(bw

5、i)通通 常不是直接相对的常不是直接相对的 断裂所形成的断裂所形成的DNADNA片段常具有碱基片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端）互补的单链尾巴（粘性末端） 内切酶的切割和修饰功能由两个内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的活性和甲基化作用活性是分开的 第6页/共53页第七页，共53页。限制性内切酶限制性内切酶EcoRIEcoRI的酶切位点及酶切产物的酶切位点及酶切产物(chnw)(chnw)连接连接 回纹(hu wn)序列第7页/共53页第八页，共53页。图12-1通过用相同的限制性内切酶切割形成(xngch

6、ng)一个重组DNA分子 第8页/共53页第九页，共53页。限制性内切酶限制性内切酶SmaISmaI的识别的识别(shbi)(shbi)及酶切位点及酶切位点平齐末端(m dun)第9页/共53页第十页，共53页。2 2、DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶：重组连接酶：重组DNADNA分子构建必不可分子构建必不可少的工具酶，能催化少的工具酶，能催化DNADNA中相邻中相邻(xin ln)(xin ln)的的3 OH3 OH和和5 5 磷磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段段DNADNA连接起来连接起来第10页/共53页第十一页，共53页。 3 3、反转录

7、酶、反转录酶 一类以一类以RNARNA为模板来指为模板来指导导DNADNA合成的合成的DNADNA聚合酶，聚合酶，故又称依赖故又称依赖于于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 通常用反转通常用反转录酶构建录酶构建(u (u jin)cDNAjin)cDNA文文库（库（cDNA cDNA librarylibrary） 第11页/共53页第十二页，共53页。4 4、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应(PCR) (PCR) PCRPCR是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA的方法的方法, ,由美由美国的国的Mullis(1986)Mullis(1986)发明发明, 1993, 1993年诺贝年诺

8、贝尔化学奖尔化学奖 PCRPCR可对特定可对特定DNADNA片段进行扩增，且可片段进行扩增，且可用痕量用痕量(hn lin)DNA(hn lin)DNA作模板，对作模板，对DNADNA纯度要求也不高纯度要求也不高, ,可在几小时内使可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝目的基因片段扩增到数百万个拷贝第12页/共53页第十三页，共53页。PCRPCR反应混合液四种反应混合液四种(s zhn)(s zhn)主要成分：主要成分：两个引物（一般为两个引物（一般为20 bp20 bp）模板模板DNADNA热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶，在酶，在9595甚至更高温度下活性

9、稳定）甚至更高温度下活性稳定）四种四种(s zhn)(s zhn)脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。PCRPCR反应在反应在PCRPCR仪上自动进行仪上自动进行第13页/共53页第十四页，共53页。PCRPCR反应从启动到结束称为一个循环，反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：每个循环包括三个步骤：1 1）变性：）变性：9595，DNADNA 双链分离成单链双链分离成单链2 2）退火）退火( (复性复性) )：5555 左右，引物与单链的左右，引物与单链的 模板模板DNADNA序列互补结合序列互补结合(jih)(jih)3 3）延伸：）延伸：7272左右，左右， Taq Taq酶通过在引物

10、酶通过在引物 的的3-OH3-OH端增加碱基的端增加碱基的 办法使引物延伸办法使引物延伸第14页/共53页第十五页，共53页。表12-2 PCR循环数与PCR产物(chnw)的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824第15页/共53页第十六页，共53页。二、载体二、载体 载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌细菌/ /酵母菌人工酵母菌人工(rngng)(rngn

11、g)染色体染色体BACBAC、YACYAC等等载体特点：载体特点： 在宿主细胞中能独立复制，即本身在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制为复制 子，有独立的复制起始位点子，有独立的复制起始位点 有限制酶切位点，允许外源基因插有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入且插 入后随载体入后随载体DNADNA分子一同进行复制或分子一同进行复制或扩增扩增 有选择标记，便于选择含重组有选择标记，便于选择含重组DNADNA分分子的子的 寄主细胞寄主细胞 分子量小，多拷贝，易于操作分子量小，多拷贝，易于操作 具有安全性等具有安全性等第16页/共53页第十七页，共53页。 （1 1）细菌）细菌(xjn)(xjn)质

12、粒：广泛应用于基因工程质粒：广泛应用于基因工程图12-6 质粒PUC18的结构(jigu)及多克隆位点 第17页/共53页第十八页，共53页。TiTi质粒及其衍生载体质粒及其衍生载体TiTi质粒包括五个区域质粒包括五个区域1. LB1. LB与与RBRB之间的之间的T-DNAT-DNA，这段序列整，这段序列整 合到植物合到植物(zhw)(zhw)基因组中基因组中2. 2. 质粒转移区质粒转移区(PT)(PT)3. 3. 冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区4. 4. 复制原点复制原点5. 5. 毒性区毒性区(Vir) (Vir) 第18页/共53页第十九页，共53页。T-DNAT-DNA区域内的所有基因与

13、转移无区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲甲(disarmed)(disarmed)后，将细菌抗生素的后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个抗性基因或其它序列插入到这个(zh ge)(zh ge)区域，形成的区域，形成的T-DNAT-DNA仍可将仍可将RBRB至至LBLB内的序列转移并整合到植物内的序列转移并整合到植物基因组。基因组。VirVir区的毒性基因是区的毒性基因是T-DNAT-DNA转移所转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制两种方式控制T-DNAT-DNA转移。转移。第19页/共53页

14、第二十页，共53页。TiTi质粒的衍生载体，广泛用作植物基因质粒的衍生载体，广泛用作植物基因(jyn)(jyn)工程中的载体：工程中的载体：（1 1）双元载体）双元载体(binary vectors(binary vectors）如如pBin19pBin19载体，具有原核生物卡那霉素载体，具有原核生物卡那霉素抗性基因抗性基因(jyn)(Aph)(jyn)(Aph)作为细菌选择作为细菌选择标 记 ， 真 核 生 物 卡 那 霉 素 抗 性 基 因标 记 ， 真 核 生 物 卡 那 霉 素 抗 性 基 因(jyn)(nos-Npt)(jyn)(nos-Npt)作为植物选择标记作为植物选择标记，pU

15、C19pUC19多克隆位点及多克隆位点及-互补显色标记互补显色标记（2 2）共整合载体）共整合载体(integrated(integratedvectors) vectors) 第20页/共53页第二十一页，共53页。RiRi质粒质粒RiRi质粒的结构与质粒的结构与TiTi质粒的结构很相似质粒的结构很相似，可以分为，可以分为T T区、区、virvir区、区、oriori区和其区和其它区域等几个部分。它区域等几个部分。T T区与区与TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA十分相似，包括十分相似，包括T T区的左右区的左右(zuyu)(zuyu)边界序列边界序列; ;TL-DNATL-DNA区区;

16、 ;TR-DNATR-DNA区。区。 第21页/共53页第二十二页，共53页。（2 2）噬菌体载噬菌体载体体1 1、噬菌体；噬菌体； 2 2、噬菌体噬菌体DNADNA； 3 3、噬菌体噬菌体DNADNA中中间间基因簇；基因簇；4 4、将连接物体外、将连接物体外包装后感染细菌，包装后感染细菌，制备制备(zhbi)(zhbi)基因基因库（用于基因库构库（用于基因库构建）建）第22页/共53页第二十三页，共53页。（3 3）克隆大片段）克隆大片段DNADNA的载体的载体(zit)(zit) 黏粒载体黏粒载体(zit)(zit) 克隆外源克隆外源 片段的长片段的长 度在度在1515 45kb 45kb

17、之间之间第23页/共53页第二十四页，共53页。细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)(BAC)上述的几种上述的几种(j zhn)(j zhn)载体都不能携载体都不能携带大于带大于50kb50kb外源外源DNADNA片段，片段，而很多真核生而很多真核生物基因长度在物基因长度在50kb50kb以上。细以上。细菌人工染色体菌人工染色体载体就是为载体就是为克隆更大的外克隆更大的外源源DNADNA片段而片段而设计构建的设计构建的图12-9 细菌(xjn)人工染色体载体pBAC 108L 及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段 第24页/共53页第二十五页，共53页。酵母人工染色体（酵母人工

18、染色体（YACYAC）YACYAC载体可以载体可以(ky)(ky)插插入大片段的入大片段的DNADNA（1-2Mb1-2Mb），成为），成为人类基因组计划人类基因组计划（HGPHGP）的一种）的一种重要工具重要工具 第25页/共53页第二十六页，共53页。三、基因分离方法三、基因分离方法 一个基因就是编码一个基因就是编码(bin m)(bin m)一条多肽链的一个一条多肽链的一个DNADNA片段片段包括：启动子、终止子、内含包括：启动子、终止子、内含子子 外显子外显子第26页/共53页第二十七页，共53页。1 1、基于、基于(jy)(jy)文库的基因分离方法文库的基因分离方法 基因文库基因文库

19、(library)(library)：是一组：是一组DNADNA和和cDNAcDNA序列克隆的集合体。从基因库中序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因文库分离基因，首先要构建基因文库第27页/共53页第二十八页，共53页。（1 1）构建基因文库）构建基因文库 基因组文库：使用与切割质粒相同的限基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组制性内切酶，将供体生物体的基因组DNADNA切成许多片段，然后将其连接到载切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组体上构成的一个重组DNADNA群体群体cDNAcDNA文库：以文库：以mRNAmRNA为模板，在反转录酶

20、为模板，在反转录酶作用下，合成作用下，合成cDNAcDNA，将其与适当载体连，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行接并转化到宿主细胞内进行(jnxng)(jnxng)扩增构建成的基因库。克隆特定基因扩增构建成的基因库。克隆特定基因 第28页/共53页第二十九页，共53页。（2 2）筛选基因库）筛选基因库利用一段核苷酸序列利用一段核苷酸序列(DNA(DNA、cDNAcDNA或寡或寡核苷酸核苷酸) )作探针作探针(probe)(probe)，用放射性同，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库可用抗体作探针，筛选基因库筛选筛选噬菌体构

21、建的库常利用菌落杂噬菌体构建的库常利用菌落杂交法：将经重组交法：将经重组(zhn z)(zhn z)噬菌体感噬菌体感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑斑 第29页/共53页第三十页，共53页。 图 12-10 菌落(jnlu)杂交技术 第30页/共53页第三十一页，共53页。（3 3）阳性克隆的分析与鉴定）阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基进一步分析、鉴定，才能得到目的基因因 序列测定序列测定(cdng)(cdng)

22、、生物信息分析、生物信息分析功能预测、功能鉴定功能预测、功能鉴定第31页/共53页第三十二页，共53页。2 2、T-DNAT-DNA标签克隆基因标签克隆基因 利用利用T-DNAT-DNA插入突变插入突变创造创造(chungzo)(chungzo)突变体，获取目突变体，获取目标基因或克隆标基因或克隆T-DNA 载体(zit)构建转化(zhunhu)植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化

23、突变体，回复功能）图12-11 T-DNA标签克隆基因的基本原理 第32页/共53页第三十三页，共53页。3 3、基于、基于PCRPCR的基因克隆的基因克隆(k ln) (k ln) 原理：根据待扩增基因的序列合成引物原理：根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究究 4 4、基因的人工合成、基因的人工合成 对于已知核苷酸序列、分子量较小的基对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小

24、片段先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由连接起来。人工合成基因可以由DNADNA自自动合成仪来完成动合成仪来完成 第33页/共53页第三十四页，共53页。第三节第三节 外源基因的导入外源基因的导入一、重组一、重组DNADNA技术技术重组重组DNADNA：利用不同生物来源的：利用不同生物来源的DNADNA分子拼分子拼接的杂种接的杂种 DNA DNA分子，是自然界中不存在的分子，是自然界中不存在的DNADNA分子分子重组重组DNADNA技术主要步骤：技术主要步骤：1) 1) 从细胞或组织获得从细胞或组织获得DNADNA并纯化并纯化2) 2) 用限制酶切割用限制酶切割DNA

25、DNA3) 3) 将所得限制片段连接到载体上将所得限制片段连接到载体上, ,形成重形成重组组DNADNA分子分子4) 4) 重组重组DNADNA导入宿主细胞，在宿主细胞内导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，复制， 产生大量相同拷贝的重组产生大量相同拷贝的重组DNADNA分子分子-克克隆隆5) 5) 克隆的克隆的DNADNA分子可以从宿主细胞中回收分子可以从宿主细胞中回收，纯化，纯化 6) 6) 克隆的克隆的DNADNA可以转录和翻译，其产品可以转录和翻译，其产品可以被分可以被分 离出来用于研究或商业离出来用于研究或商业(shngy)(shngy)开开发。发。 第34页/共53页第三十五页，共53页

26、。重组重组(zhn (zhn z)DNAz)DNA分子分子第35页/共53页第三十六页，共53页。二、植物遗传转化方法二、植物遗传转化方法1 1、农杆菌介导法、农杆菌介导法（1 1）根癌农杆菌）根癌农杆菌(Ti(Ti质粒质粒) )（2 2）发根农杆菌）发根农杆菌(Ri(Ri质粒质粒) ) 侵染后使植物细胞产生侵染后使植物细胞产生(chnshng)(chnshng) 许多毛状根许多毛状根( (发状根发状根) )第36页/共53页第三十七页，共53页。图12-15 棉花转基因植株生产(shngchn)过程F1. 共培养2. 在选择培养基上筛选3. 筛选获得的抗性愈伤 5. 胚萌发成苗6. 转基因植

27、株移栽大田4. 抗性愈伤分化成胚状体第37页/共53页第三十八页，共53页。2 2、基因、基因(jyn)(jyn)枪枪法法 基因枪法基因枪法 生物生物(shngw)(shngw)弹法弹法 微粒微粒枪法枪法 微粒轰击法微粒轰击法金、钨金、钨依赖高速的金属微粒将外源基因导入依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术活细胞的一种转化技术优点：无宿主限制，可以对任何基因优点：无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究型材料进行转化研究 第38页/共53页第三十九页，共53页。第四节第四节 转基因生物转基因生物(shngw)(shngw)的的检测与鉴定检测与鉴定 PCR PCR Southern blotSouthern blotNorthern blotNorthern blotWestern blotWestern blot性状性状( (表型表型) )鉴定鉴定第39页/共53页第四十页，共53页。PCRSouthern blot第40页/共53页第四十一页，共53页。Western blotNorthern blot第41页/共53页第四十二页，共53页。第42页/共53页第四十三页，共53页。第43页/共53页第四十四页，共53页。第44页/