基因毒性杂质-基毒、重金属

1、遗传毒性杂质遗传毒性：泛指各种因素（物理、化学因素）与细胞或生物体的遗传物质发生作用而产生的毒性。 1、致突变性：与DNA相互作用产生直接潜在的影响，使基因突变（bacteria reverse mutation（Ames）试验）2、致癌性：具有致癌可能或倾向（需要长期研究！）3、警示结构特征：一些特殊的结构单元具有与遗传物质发生化学反应的能力，会诱导基因突变或者导致染色体重排或断裂，具有潜在的致癌风险。遗传毒性物质：在很低的浓度下即可诱导基因突变以及染色体的断裂和重排，因此具有潜在的致癌性。EMA通告（1）、具体事项：1、哪些品种中会出现甲磺酸酯（或甲磺酸烷基酯）。特别是甲磺酸盐等形式的AP

2、I或其合成中用到甲磺酸的API，甲磺酸烷基酯-甲磺酸甲酯、乙酯、其它低级醇酯，应认定为潜在杂质。2、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐的API。应说明类似物质磺酸烷基酯或芳基酯污染的危险。3、限度要求：无其它毒性数据时，这些高风险杂质应依据TTC设定限度。1.5g÷以g为单位的最大日剂量得ppm限度。4、法律依据：EP专论要求凡以甲磺酸盐和羟乙基磺酸盐形式存在的API，均应在其生产过程中采取以下安全措施：必须对生产工艺进行评估以确定家磺酸烷基酯（羟乙基磺酸烷基酯）形成的可能，特别是反应溶媒含低级醇的时候，很可能会出现这些杂质。必需时需对生产工艺进行验证以说明在成品中未检出这类杂质。

3、（2）、落实措施：1、API生产是否涉及在甲磺酸（羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸等低分子量磺酸）或相应酰氯存在下，使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等低级脂肪醇（如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等）。2、对相应酯形成的可能性是否降到最低。3、是否有有效的清除精制步骤。设备清洗-是否设计的低级脂肪醇的使用（方法，TTC限度）？起始物料（低分子量磺酸盐或酰氯）中是否控制了其低级脂肪醇酯（方法，TTC限度）？当被磺酸酯或相关物质污染的磺酸用于API合成时能否保证其中潜在的遗传毒性杂质不超过TTC？应考虑各种烷基或芳基磺酸酯杂质累积的风险。API最后一步用到的磺酸衍生物，应进行风险分析。收回溶剂： 中的磺

4、酸酯类杂质（如乙醇中的EMS、甲醇中的MMS、异丙醇中的IMS）的富集和残留是否进行了控制。制剂过程：甲磺酸盐等相关形式的API的制剂过程（制粒、包衣）是否使用了醇，是否有足够灵敏的方法监控只集中杂质处于TTC水平！储存过程：甲磺酸盐等相关形式的API及制剂储存过程中是否会存在形成烷基或芳基磺酸酯。整改：存在风险必须研究，报告监管部门并按相关程序提交变更申请。遗传毒性杂质研究相关指导原则ICH Q3A（R2）、ICH Q3B（R2）（遗传毒性杂质仅有提及）EMA：Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities，2006。EMA：Questions

5、 and Answers on the CHMP Guideline on the limits of genotoxic Impurities，2008。FDA：Guidance for Industry:Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products:Recommended Approaches. Draft，2008。ICH M7：Draft consensus guideline assessment and control of DNA reactive(Mutagenic) impuriti

6、es in pharmaceutical to limit potential carcinogenic riskICH M7目前状态：2013年2月6日发布，征求意见历时17个月（一般6个月）后，于2014年7月15日正式发布。现在进入ICH区域实施期（在美国联邦注册公布，经CHMP和欧盟委员会批准，在日本翻译）指南比较复杂，需要企业和卫生部门调整程序，因此，预期在ICH公布后18个月后方可全面实施M7。与指南一起发布了实施指导：M7发布后的AMES试验需立即实施M7标准。M7发布前乙腈开始2b/3期试验的项目可以继续，结构活性关系定量分析、杂质评估和文件记录不是必须的。M7发布后的上市申请

7、，如未进行2b/3期试验，须在36个月内完成上述试验。ICH M7适用范围：主要用于新药（原料药、制剂）的临床研究阶段及上市注册申请。包括孤儿药，新复方制剂，新制剂，新剂型的申请。（原料药没有改变，不做回顾性评价）也适用于上市后的相关变更，包括临床使用的变化。A.上市后API生产变更：合成路线、试剂、溶剂以及工艺条件的变更等可能导致新的遗传毒性杂质产生或已有的遗传毒性杂质含量发生改变。B.上市后制剂的变更：处方、生产工艺、剂型、规格改变可能导致新的遗传毒性杂质或已有的遗传毒性杂质含量发生改变。C.上市后药品的临床使用发型变更：剂量的显著增加、使用时间的增加、适应症的变更（例如，从危及生命的适应

8、症变为一般严重适应症），要求对遗传毒性杂质的限度进行重新评估。在剂量或者治疗时间不改变的情况下，已上市药品增加新的给药途径或者扩大患者人群（即使包括孕妇和/或儿童）在临床使用中的变更通常不要求重新评估。依照ICH S9指导原则的抗肿瘤新药的申请不适用M7。（以健康人进行药代研究除外）ICH M7要回答的问题：提供了一个可用于遗传毒性杂质鉴别、分类、定量分析和控制的可行性框架。限制潜在的致癌风险提供安全性评价和质量风险控制的理念对ICHQ3A 和Q3B的补充I：如何根据结构活性分析评估杂质潜在的遗传毒性？II.如何确定杂质TTC？遗传毒性杂质的可接受水平是多少？III.为什么潜在基因毒性物质具有

9、相似的分子结构？IV.是否可以采用毒理学关注阈值（TTC）来规定遗传毒性杂质的水平？V.计算TTC时，是否可以将多个遗传毒性杂质合并计算？VI.哪些是可接受的特殊情况？日摄入量大于TTC的情况？ICH M7根据风险级别实施分类管理：类别定义及解释控制措施1已知的致突变致癌物致突变和致癌性数据为阳性。基于文献中报告的动物/人体毒性。现有的公开数据库，如ToxNet、NTP、InChem、BG-Chemie、日本现有化学物质数据库和/或市售数据库，如VITIC和Leadscope。控制在化合物特定的限度以下2已知具有诱变性，致癌效应未知致突变数据或其它相关诱变数据阳性，但致癌性未知。（细菌诱变呈阳

10、性，无啮齿动物致癌数据）控制在限度以下（适当的TTC）3含有警示结构，但与原料药的结构无关，无突变性数据集有警示结构，有潜在遗传毒性风险。Q（SAR）系统显示警示结构具有遗传毒性，但与活性物质结构无关。控制在限度以下（适当的TTC），或进行细菌致突变性试验，如细菌突变Ames试验阳性=2类；细菌突变Ames试验阴性=5类4含有警示结构，与原料药或有关物质有相同警示含有警示结构，与原料药或有关物质有相同警示（例如工艺中间体），经测试为无突变性与非诱变性杂质同等对待5无警示结构无警示结构，或警示结果具有充分的数据证明其不具备诱变性和致癌性与非诱变性杂质同等对待警示结构单元-基因毒性杂质识别的起点警

11、示结构单元：杂质结构中的某些具有与遗传物质发生化学反应能力特殊基团或亚单位。警示结构对于杂质的遗传毒性和致癌性具有重要提示作用：连接工艺控制、分析检测、毒理学评估的纽带。提高筛选效率，较少毒理学评估的工作量。在缺乏杂质安全性数据支持的情况下，EMA、FDA、ICH相关指导原则中均将警示结构作为区分普通杂质和潜在遗传毒性杂质的主要指标。常见警示结构单元模型：名称结构备注酰卤R=除-OH、-SH之外的任何原子/基团烷基或苯基磺酸酯R=C5的烷基（包括卤代烷基）或苯基R1=除-OH、-SH、-O-、-S-之外的任何原子/基团烷基或苯基磷酸酯R=C5的烷基（包括卤代烷基）或苯基R1=除-OH、-SH、

12、-O-、-S-之外的任何原子/基团N-羟甲基衍生物R=任何原子/基团单卤代烯烃R1、R2（或R3）=H或烷基R3（或R2）=除卤素外的任何原子/基团硫芥R=任何原子/基团氮芥R=任何原子/基团-丙酸内酯含有该结构单元的任何物质-丙磺酸内酯含有该结构单元的任何物质环氧和氮丙啶类R=任何原子/基团卤代烷烃R=任何原子/基团烷基亚硝酸酯R=任何原子/基团不饱和酮R1/R2=任何原子/基团（芳基和C5的烷基除外）；R=任何原子/基团（-OH、-O-除外）小分子脂肪或芳香醛R=脂肪或芳香基，不饱和醛除外醌含有该结构单元的任何物质肼R=任何原子/基团单（双）取代芳胺Ar=芳香环或芳杂环R1=H、甲基、乙基

13、R2=甲基、乙基，但以下情况除外：1、邻位双取代或邻位有羧基取代2、与氨基相同的芳环上有磺酸基取代；芳基取代的偶氮化物Ar=芳香环或芳杂环，与偶氮基相连的芳环上同时又磺酸基取代的情况除外（呋喃并）香豆素类衍生物含有该结构单元的任何物质非遗传毒性致癌物的警示结构硫酰基衍生物或R、R1、R2=任何原子/基团R3=除-OH、-SH、-O-、-S-之外的任何原子/基团；氨基硫甲酸酯除外多卤代（多）环烷烃3个或3个以上的卤素原子连结在同一个环烷烃上卤代苯不包含一下两种情况：1、2个取代卤素原子呈邻位或间位；2、含有3个以上的羟基取代卤代多环芳烃Ar=萘或联苯卤代二苯并二噁烷X=F、Cl、Br、IICH

14、M7 限度控制的基本策略1）、PDE法适用于有阈值效应的遗传毒性杂质，即超过一定限度时才会产生遗传毒性的杂质；限度确定参照残留溶剂限度的计算方法，根据相关动物的无可见效应剂量（NOEL）计算其可接受的日暴露量（PDE），再根据药品的最大日剂量计算出杂质的接受限度。PDE=NOEL×重量调整因子F1×F2×F3×F4×F5PDE：允许的日暴露量（mg/天）NOEL：无毒性反应剂量F1F1：物种之间的外推法因子（F1：狗为2，小鼠为12，其他物种为10）F2：个体差异因子F3：毒性研究的周期因子F4：严重毒性的因子F5：如果只有LOEL（最低无毒性

15、反应剂量）时的因子2）、TTC法对于无阈值效应的遗传毒性杂质，引入毒理学相关阈值（TTC）的概念：假设患者终生用药的癌症发生率不超过10万分之一，从高浓度下进行的致癌性试验数据线性外推到极低浓度得到的一个理论值。此类杂质，如果每日摄入量低于1.5g，那么患者因服药导致癌症发生的额外风险，可以忽略不计。TTC是一个风险管理工具，采用的是概率的方法：假如有一个潜在的遗传毒性的杂质，并且我们对它的毒性不太了解，如果它的每日摄入量低于TTC值（1.5g/日），那么它的致癌风险将不会高于10-5的概率。TTC不能被理解为绝对无风险的保障。3）、引入“短于终生”LTL（Less-than-lifetime

16、）限度：基于TTC可接受的限度为1.5g/day是假设患者终生服药的基础上得到的理论值，在LTL遗传毒性杂质限度的范围为：1.5g/day×365days×70years（15550 days）=38.3mg设计出平均分配在累计暴露量天数中的方法，对于临床研究和上市药物不同用药时间可接受的限度（摄入量）：Acceptable Intakes for an Individual ImpurityDuration of treatment1month1-12 month1-10 years10 years to lifetimeDaily intake g/day1202010

17、1.54）、含有多个遗传毒性杂质的限度要求：基于TTC原理，当API中含有不超过两个2类或3类遗传毒性杂质时，分别单个控制，超过2个时，按照下表所述进行总量限制。Acceptable Total Daily Intakes for Multiple ImpurityDuration of treatment1month1-12 month1-10 years10 years to lifetimeDaily intake g/day12060305临床试验时间超过3年，按照上市药品的要求进行控制。制剂中的降解产物需单独控制。1类以及API中的降解物需单独控制，不计入总限度。5）、明确了需高度关

18、注的危险物质限度原则：类黄曲霉素aflatoxin-like-、N-亚硝基N-nitroso-化合物和氧化偶氮结构azoxy structures 致癌性明确，可能会显示出非常高的诱变性，可接受摄入量应显著低于M7定义的可接受摄入量，TTC 1.5g/day不适用于这类物质。可以应用M7的原理，具体问题具体分析，调整药物研发和上市药品中的可接受摄入量。如已有近似的相关结构的基因致癌数据的方法来判断研发和上市药品中相应杂质的可接受摄入量。ICH M7：API的四种控制策略1、在最终API标准中采用适合的方法对相关杂质进行检测，进行常规控制，达到适用的“短于终生”（LTL）限度（终产品控制）根据I

19、CH Q6A，如果API中的遗传毒性杂质在至少6个连续的中试批次或3个连续的生成批次中，测得结果均低于可接受限度的30%，则可以论述进行定期检测；如果不满足该条件，则建议对原料进行常规检测。2、对适宜的中间体中遗传毒性化合物的常规控制：采用合适的方法对原材料，起始物料或中间体的相关杂质进行检测，或进行生产过程的控制，同时制定可接受标准，使API杂质达到适宜的LTL限度。（过程控制终产品控制）3、基于对工艺的认识，采用合适的分析方法对原材料，起始物料或者中间体的杂质进行检测，或进行生产过程控制，同时确认这种控制方法能够保证API杂质水平在可接受限度以下。（过程控制） 对适宜中间体中遗传毒性化合物

20、的常规控制，且限度适用的LTL限度；充分的杂质危害性知识及去处和清除知识；拟定工艺能使最终API杂质减少至30%适用LTL-限度。以上条件均符合时方可采用4、全面深入的工艺理解（包括杂质危害性及去处和清除知识），基于科学的风险评估，以取代遗传毒性化合物的标准控制。特别适用于不稳定（如 亚硫酰氯）以及合成路线早期引入，但已被有效清除的杂质；工艺后期引入的则需要提供与工艺相关的数据来充分论证该策略的合理性；根据对杂质去向和消除产生影响的理化特性和工艺因素，包括化学反应性、溶解性、挥发性、离解性和所有用于去除杂质的物理处理步骤进行风险评估，评估结果可以用来作为杂质被工艺所清除的预估因子。控制策略的相

21、关考虑1、采用选项4，如果与选项3一样仅根据科学原理来进行论述是不够充分的，还需要提交相关分析数据来支持控制方法。后续化学反应中杂质的结构变化（去向）中试批次分析数据。可根据实验室级别研究中的加标研究，来说明该杂质的去向/清除论证是严谨的，能够持续地保证杂质在最终API中残留量超过可接受限度的可能性可以忽略。如果用于研发阶段的小规模模型被认为不能代表商业规模，则一般需要确认中试规模和/或初始商业批次中所用的控制是适当的。2、若选项3或4得不到证实的话，则需要采用选项1或2。对于在较后合成步骤中引入的杂质，一般应采用选项1。3、对于已经定性为遗传毒性的潜在降解杂质，须说明该降解途径是否与原料药和

22、制剂的生产工艺和/或其所拟的包装和存贮条件相关。建议采用设计良好的加速稳定性试验（如40/75%，6个月），采用拟定包装形式、适当分析方法来确定潜在降解产物的相关性。或采用设计良好的动力学等效时间更短温度更高的稳定性试验，来针对拟定商业包装进行试验，在开始长期稳定性试验前确定降解途径相关性。对于了解在降解途径，及产品中尚未发现的潜在降解产物的相关性尤其重要。4、若所潜在降解产物在所拟包装和存贮条件下形成，且接近可接受限度，则应采取措施控制降解产物的形成。并应监控采用所拟存贮条件、商业包装下长期稳定性试验中原料药或制剂的质量，并在质量标准中控制该杂质。EMA/CHMP金属催化剂或金属试剂残留量限度规定指导原则1）、按风险级别分类管理第1类金属：具有显著安全性担忧。已知或怀疑的致癌性其他显著毒性。1A亚组：Pt、Pd1B亚组：Ir、Rh、Ru、Os1C亚组：Mo、Ni、Cr、V第2类金属：具有低的安全性担忧。潜在的较低毒性。Cu、Mn等。第3类金属：安全性担忧最小。无明显