第五章酶的固定化-2013-11-28

1、Chapter 5 The immobile of Enzyme，Cell and Protoplast 酶、细胞、原生质体固定化酶、细胞、原生质体固定化游离酶的缺点游离酶的缺点酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活酶不易回收利用（酶的一次性使用）酶不易回收利用（酶的一次性使用）产物不易分纯，且难连续化生产产物不易分纯，且难连续化生产酶的催化效率不够高酶的催化效率不够高Contents of chapter 5概述概述第一节第一节 酶固定化酶固定化第二节第二节 细胞固定化细胞固定化第三节第三节 原生质体固定化原生质体固定化 2 . 什么是固定化酶？什么是固定化

2、酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性水不溶性载体载体水溶性酶水溶性酶活化基团固定化酶酶的固定化固定化酶概念固定化酶概念指固定在一定指固定在一定载体载体上并在上并在一定的空间范围内一定的空间范围内进行催进行催化反应的酶。化反应的酶。通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法制备成的具有催化活性的制备成的具有催化活性的水不溶性水不溶性酶。酶。2. 固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法吸附法吸附法离子键结合法离子键结合法共价键结合法共价键结合法交联法交联法凝胶包埋法凝胶包埋法半透膜包埋法半透膜包埋法固定化固定化方法方法非共价非共价结合法结合法化学化学结合法结合法

3、包埋法包埋法热处理法热处理法吸附法吸附法1. 吸附作用力吸附作用力2. 固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石3. 优缺点优缺点（3）包埋法）包埋法将酶或含酶菌体将酶或含酶菌体包埋包埋在各种在各种多孔载体多孔载体中，使酶固定中，使酶固定化的方法称为包埋法。化的方法称为包埋法。只适合作用于小分子底物和产物的酶只适合作用于小分子底物和产物的酶。凝胶包埋法（网格型）凝胶包埋法（网格型）半透膜包埋法（微囊型）半透膜包埋法（微囊型）包埋法包埋法1）凝胶包埋法（网格型）凝胶包埋法（网格型）将酶或含

4、酶菌体包埋在将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶高分子凝胶细微网格中，制细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。为凝胶包埋法。首先被采用的网格包埋法是：首先被采用的网格包埋法是：u 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶u 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶u 淀粉酶淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺丙稀酰胺引发剂引发剂inactiation2）半透膜包埋法（微囊型）半透膜包埋法（微囊型）将酶或含酶细胞包埋在将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜高分子半透膜中的固定化方中的固定化方法。法。界面聚合法界面聚合法是用化学手

5、段制备微囊的方法。利用亲水性单体和是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。而将酶包裹起来。（3）结合法）结合法1）共价结合法）共价结合法 通过共价键将酶与载体结合的方法。通过共价键将酶与载体结合的方法。 结合方法结合方法 .将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶联反应；联反应； 与载体共价结合的酶的功能基团与载体共价结合的酶的功能基团 -氨基，氨基，-氨基，氨基，,或或位的羧基、巯基、羟基、咪位的羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。唑基、酚基等

6、。载体载体天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等）天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等）无机物（玻璃、陶瓷等）无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）优缺点优缺点.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。或存在盐类等原因而轻易脱落。 .缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂；缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。降低。载体活化方法载体活化方法A重氮法重氮法B叠氮法叠氮法C烷基化反应法烷基化反应法D溴化氰法溴

7、化氰法A重氮法重氮法反应示意式反应示意式 NH2NaNO2/HClN2+Cl-酶-TyrN=NOHCH2酶重氮盐衍生物载体固定化酶A重氮法重氮法将含有将含有苯氨基苯氨基的不溶性载体与的不溶性载体与亚硝酸亚硝酸反应，生成反应，生成重重氮盐衍生物氮盐衍生物，使载体引进活泼的，使载体引进活泼的重氮基团重氮基团。载体活化后，活泼的载体活化后，活泼的重氮基团重氮基团可与酶分子中的可与酶分子中的酚基酚基或或咪唑基咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。发生偶联反应而制得固定化酶。B. 叠氮法叠氮法反应示意式反应示意式OCH2COOHOCH2COOCH2CH3OH/HClOCH2CONHNH2NH2NH2（肼）O

8、CH2CON3NaNO2/HClOCH2CONH-酶酶酶-NH2B. 叠氮法叠氮法对含有对含有羧基羧基的载体，与的载体，与肼基肼基作用生成含有作用生成含有酰肼基团酰肼基团的载体，再与的载体，再与亚硝酸亚硝酸活化，生成活化，生成叠氮化合物叠氮化合物。最后。最后与与酶偶联酶偶联。 C烷基化反应法烷基化反应法含含羟基羟基的载体可用的载体可用三氯三嗪三氯三嗪等多卤代物进行活化，形等多卤代物进行活化，形成含有成含有卤素基团卤素基团的活化载体。的活化载体。卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。基化反应，制备成固定化酶。OHO酶

9、OD溴化氰法溴化氰法本方法主要用本方法主要用溴化氰（溴化氰（CNBr）活化多糖类（含有活化多糖类（含有羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数以琼脂糖为载体的占多数），生），生成成亚氨基碳酸衍生物亚氨基碳酸衍生物。D 溴化氰法溴化氰法亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。氨基反应，制成固定化酶。D 溴化氰法溴化氰法用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。用很广，特

10、别用作亲和层析，有着良好的性能。共价结合法中载体的活化方法共价结合法中载体的活化方法重氮法重氮法叠氮法叠氮法烷基化法烷基化法溴化氰法溴化氰法含有苯氨基（含有苯氨基（亚硝酸亚硝酸）含有酰肼基含有酰肼基/羧基（羧基（亚硝酸亚硝酸）含有羟基（含有羟基（三氯三嗪等多卤代物三氯三嗪等多卤代物）含有羟基（含有羟基（溴化氰活化溴化氰活化）2）交联法）交联法借助借助双功能试剂双功能试剂使使酶分子之间酶分子之间发生交联作用，制成发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。含酶菌体或菌体碎片的固定化。常用试剂：戊二醛、异氰酸

11、酯、常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱（碱（shiff）。）。第一篇报道第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶。交联的固定化酶。（4）热处理法）热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只热处理法只适用于热稳定性较

12、好的酶适用于热稳定性较好的酶的固定化，在的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。起酶的变性失活。步骤步骤step总体积总体积Volume(ml)总活力总活力Total activity(u)总蛋白总蛋白Total protein(mg)比活力比活力Specific activity(u/mg)纯化倍数纯化倍数Purification(fold)收收 率率Yield(%)粗酶粗酶1040460070168.1乙醇沉淀乙醇沉淀9014257410.9DEAE-Sepharose柱层析柱层析11466292.0HiTrap-

13、Q柱层析柱层析19422180.3下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。2736.913080.223314.5140726.714.88.551.410030109实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 实验原理：实验原理：载体：尼龙载体：尼龙固定化方法：共价结合法固定化方法：共价结合法尼龙尼龙长链中的酰胺键经长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的水解后，产生游离的-NH基基，在一定条件下与双功能试剂，在一定条件下与双功能试剂戊二醛戊二醛中的一中的一个个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个基缩合，戊二醛中的另一个

14、-CHO基则与基则与酶中的游离氨基缩合，形成酶中的游离氨基缩合，形成尼龙尼龙(载体载体)-戊二醛戊二醛(交交联剂联剂)-酶酶，即尼龙固定化酶。，即尼龙固定化酶。实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶的固定化步骤：酶的固定化步骤：（1）每组取）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下水的甲醇溶液中，在室温下保温保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。后用水冲去污物，用吸水纸吸干。（2）将尼龙布用）将尼龙布用3.65mol/L HC

15、l溶液在室温下水解溶液在室温下水解45min，用水洗至，用水洗至pH值中性。值中性。（3）将尼龙布用）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶的固定化步骤：酶的固定化步骤：（4）取出尼龙布，用）取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH值值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（立即用酶液（0.51mg/mL）在）在4下固定下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。）。（5）从酶液中取出尼龙

16、布（保留残余酶液作测定）从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用用），用0.5mol/L NaCl溶液（用溶液（用0.1mol/L磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（pH值值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。即为尼龙固定化酶。实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶活力测定：酶活力测定：（1）溶液酶活力测定：取）溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入酶液，加入1.8mL激激活剂，于活剂，于37下预热下预热10min，加入，加入37预热的预热的0.5%酪蛋白溶液酪蛋白溶液1mL，准确反应，准确反应10min，然后加入，然后加入10%三氯乙酸溶液三

17、氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以管相同，以4000r/min的转速离心的转速离心5min或过滤，取或过滤，取其上清液于波长其上清液于波长280nm处测定消光值。处测定消光值。 在上述条件下，每在上述条件下，每10min增加增加0.001个消光值为个消光值为1个酶单位个酶单位(U)(以下同以下同)。 实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 酶活力测定：酶活力测定：（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。（3）固定化

18、酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。实验实验 木瓜蛋白酶的固定化木瓜蛋白酶的固定化 结果计算：结果计算： 固定化酶总活力固定化酶总活力活力回收活力回收= 100% 溶液酶总活力溶液酶总活力 固定化酶总活力数固定化酶总活力数相对活力相对活力= 100% 溶液酶总活力数溶液酶总活力数-残留酶活力数残留酶活力数3. 固定化酶的性质固定化酶的性质（1）固定化后酶活力的变化固定化后酶活力的变化酶活力降低，反应速度下降酶活力降低，反应速度下降原因：原因：1）构象改变构象改变：酶分子

19、在固定化过程中，空间构象会：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。2）空间位阻空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限：固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用。定位作用。3）内扩散作用内扩散作用：内扩散阻力使底物分子于活性中心：内扩散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。的接近受阻。4）立体障碍立体障碍：包埋时酶被高分子物质包埋，大分子：包埋时酶被高分子物质包埋，大分子不能透过膜与酶接近。不能透过膜与酶接近。（2）固定化酶的稳定性）固定

20、化酶的稳定性大多提高大多提高1）稳定性大多提高）稳定性大多提高热稳定性大多提高，有些反而下降热稳定性大多提高，有些反而下降对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对不同对不同pH（酸度）稳定性，对分解酶的稳定性、（酸度）稳定性，对分解酶的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性提高。贮存稳定性和操作稳定性提高。2）稳定性提高的原因）稳定性提高的原因固定化后，酶分子与载体多点连接，可防止酶分子固定化后，酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；伸展变形；酶活力的缓慢释放；酶活力的缓慢释放；抑制自降解，提高了酶稳定性。抑制自降解，提高了酶稳定性。青霉素酰化酶：固定化酶在青霉

21、素酰化酶：固定化酶在pH5.510.3稳定，稳定，游离酶仅在游离酶仅在pH7.09.0稳定。稳定。（3）固定化酶的最适温度变化）固定化酶的最适温度变化可能提高可能提高固定化酶的最适作用温度一般与游离酶固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多差不多，活，活化能变化也不大，有些会发生变化；化能变化也不大，有些会发生变化；由于固定化，酶的热稳定性提高，所以最适温度也由于固定化，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高；随之提高；固定化酶的最适作用温度可能会受到固定化方法和固定化酶的最适作用温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。固定化载体的影响。（4）固定化酶的最适）固定化酶的最适pH发生改变发

22、生改变酶经固定化后，对底物作用的最适酶经固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力和酶活力-pH曲线常常发生偏移；曲线常常发生偏移；2）载体性质对最适）载体性质对最适pH的影响；的影响；一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适化酶，其最适pH。一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定化酶，其最适化酶，其最适pH。1）pH对酶活性的影响：对酶活性的影响：改变酶的空间构象改变酶的空间构象影响酶的催化基团的解离影响酶的催化基团的解离影响酶的结合基团的解离影响酶的结合基团的解离改变底物的解离状态，酶

23、与底物不能结合或结合改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。后不能生成产物。3）产物性质对最适）产物性质对最适pH的影响；的影响；产物酸性，其最适产物酸性，其最适pH。产物碱性，其最适产物碱性，其最适pH。产物中性，其最适产物中性，其最适pH不变不变。（5）底物特异性）底物特异性发生改变发生改变对对作用于低分子底物的酶作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异，固定化前后的底物特异性性没有明显变化没有明显变化；对于对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶的酶，固定化酶的底物特异性往往会，固定化酶的底物特异性往往会发生变化发生变化

24、。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。阻作用引起的。（6）固定化酶的米氏常数（）固定化酶的米氏常数（Km）发生改变发生改变当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制，造成表当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制，造成表观观Km；由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使变化，从而使Km变化。当载体与底物电荷相反，变化。当载体与底物电荷相反，固定化酶的表观固定化酶的表观Km；当载体与底物电荷相同，；当载体与底物电荷相同，固定化酶的表观固定化酶的表观Km显著增加。显著增加。Km值又受

25、载体的疏水性及溶液中离子强度的影响。值又受载体的疏水性及溶液中离子强度的影响。改变改变可能改变可能改变发生变化发生变化固定化酶的性质固定化酶的性质固定化酶固定化酶活力活力固定化酶的固定化酶的稳定性稳定性固定化酶的固定化酶的最适温度最适温度固定化酶的固定化酶的最适最适pH固定化酶的固定化酶的底物特异性底物特异性固定化酶的固定化酶的米氏常数（米氏常数（Km）活力活力降低降低大多大多提高提高可能可能提高提高载体性质载体性质带负电荷：固定化酶带负电荷：固定化酶pHpH带正电荷：固定化酶带正电荷：固定化酶pHpH产物性质产物性质产物酸性：固定化酶产物酸性：固定化酶pHpH产物碱性：固定化酶产物碱性：固定

26、化酶pHpH产物中性：固定化酶产物中性：固定化酶pHpH不变不变作用于小分子底物的酶作用于小分子底物的酶不变不变可作用于小分子及大分子可作用于小分子及大分子底物的酶改变底物的酶改变载体与底物电荷相反载体与底物电荷相反Km降低降低载体与底物电荷相同载体与底物电荷相同Km升高升高5.4 细胞和原生质体固定化细胞和原生质体固定化1、细胞固定化、细胞固定化细胞的固定化细胞的固定化：通过各种方法将：通过各种方法将细胞细胞与与水不溶性载水不溶性载体体结合，制备固定化细胞的过程。结合，制备固定化细胞的过程。固定化细胞固定化细胞：指被：指被限制自由移动限制自由移动的细胞，即细胞受的细胞，即细胞受到物理、化学等

27、因素的约束或限制在一定的空间界到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能反复或连续限内，但细胞仍保留催化活性并具有能反复或连续适用的活力。适用的活力。（1） 固定化细胞的分类固定化细胞的分类按细胞类型分类按细胞类型分类固定化固定化微生物微生物细胞细胞固定化固定化植物植物细胞细胞固定化固定化动物动物细胞细胞按生理状态分按生理状态分固定化固定化死死细胞细胞固定化固定化活活细胞细胞u固定化固定化静止静止细胞和细胞和饥饿饥饿细胞细胞u固定化固定化生长生长细胞（细胞（增殖增殖细胞）细胞）：完整细胞、细胞碎片、细胞器：完整细胞、细胞碎片、细胞器：较适合于单酶反应：较适合

28、于单酶反应：更适合于多酶反应：更适合于多酶反应（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点）固定化（增殖）细胞的优点和缺点优点优点.有利于提高细胞的存活率和稳定性；有利于提高细胞的存活率和稳定性；.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；.提高发酵稳定性，可在较长时间内反复和连续使提高发酵稳定性，可在较长时间内反复和连续使用；用；.易与培养液与产物分开，利于产品的分离纯化，易与培养液与产物分开，利于产品的分离纯化，提高产品质量。提高产品质量。（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点）固定化（增殖）细胞的优点和缺点缺点缺点.利用的仅是利用的仅是胞内酶胞内酶，副产物多；，副产物

29、多；.细胞膜、细胞壁及载体存在细胞膜、细胞壁及载体存在扩散限制扩散限制作用；作用；.载体形成的载体形成的孔隙孔隙大小影响高分子底物和产物的通大小影响高分子底物和产物的通透性。透性。（3）固定化细胞的制备（）固定化细胞的制备（P169-178）一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。固定固定方法方法吸附法吸附法包埋法包埋法：制备固定化细胞的主要方法。：制备固定化细胞的主要方法。：凝胶包埋法是应用最广泛的方法。：凝胶包埋法是应用最广泛的方法。琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋

30、法海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法角叉菜胶包埋法角叉菜胶包埋法明胶包埋法明胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法例：相对分子量为例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，的光交联聚氨酯预聚物等，加入加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。，就可制得。活性炭固定化产脂肪酶的发酵性丝孢酵母

31、细胞的研究活性炭固定化产脂肪酶的发酵性丝孢酵母细胞的研究摘要：以活性碳为载体，采用吸附培养的方法将发摘要：以活性碳为载体，采用吸附培养的方法将发酵性丝孢酵母细胞固定化，确定了吸附培养固定化酵性丝孢酵母细胞固定化，确定了吸附培养固定化的适宜条件，并测定了固定化细胞的保存稳定性和的适宜条件，并测定了固定化细胞的保存稳定性和使用稳定性。使用稳定性。结果表明，在结果表明，在100mL发酵培养基中发酵培养基中(250mL摇瓶摇瓶)添添加加1.0 g活性碳于活性碳于30、160 r/min吸附培养吸附培养48h，可，可吸附较多细胞。将固定化细胞于吸附较多细胞。将固定化细胞于40保存保存30 d脂肪脂肪酶活

32、力无明显下降。用固定化细胞催化人豆油转酯酶活力无明显下降。用固定化细胞催化人豆油转酯化反应，连续催化化反应，连续催化5批后酯化率仍超过批后酯化率仍超过50。载体的预处理载体的预处理将一定量活性炭颗粒置于将一定量活性炭颗粒置于lmol/L HCl溶液中，于溶液中，于50搅拌搅拌1h后除去酸液，用去离子水反复冲洗至洗后除去酸液，用去离子水反复冲洗至洗液液pH值为中性，然后于值为中性，然后于130烘干待用。烘干待用。固定化细胞的吸附培养与处理固定化细胞的吸附培养与处理在在l00mL发酵培养基中发酵培养基中(250mL摇瓶摇瓶)加入一定量经加入一定量经预处理的载体，接入预处理的载体，接入10的液体种子

33、，于的液体种子，于30、160r/min摇床发酵，滤出载体，用去离子水和摇床发酵，滤出载体，用去离子水和50mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤洗涤3次，风干制得次，风干制得固定化细胞。固定化细胞。固定化细胞的保存稳定性固定化细胞的保存稳定性将固定化细胞置于将固定化细胞置于4保存，定期取样测定胞内脂保存，定期取样测定胞内脂肪酶活力，以游离细胞作对照旧。肪酶活力，以游离细胞作对照旧。固定化细胞的使用稳定性固定化细胞的使用稳定性用固定化细胞催化大豆油进行转酯化反应，每反应用固定化细胞催化大豆油进行转酯化反应，每反应一批后，回收固定化细胞，用丙酮充分洗涤，风干，一批后，回收固定化细胞

34、，用丙酮充分洗涤，风干，加入新的反应体系中，继续进行转酯化反应。加入新的反应体系中，继续进行转酯化反应。5.4 细胞和原生质体固定化细胞和原生质体固定化2. 原生质体的固定化原生质体的固定化（1）原生质体的制备）原生质体的制备1）制备过程）制备过程 将将对数生长期对数生长期的细胞收集的细胞收集悬浮在含有悬浮在含有渗透压稳渗透压稳定剂定剂的高渗缓冲液中的高渗缓冲液中加入加入水解水解酶酶分离分离得到得到原生质体原生质体2）细胞壁水解酶）细胞壁水解酶细菌：溶菌酶细菌：溶菌酶酵母菌：蜗牛消化酶酵母菌：蜗牛消化酶霉菌：几丁质酶霉菌：几丁质酶植物：纤维素酶，果胶酶植物：纤维素酶，果胶酶（2）原生质体固定化

35、）原生质体固定化 将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法包埋法制成固定制成固定化原生质体。化原生质体。（3）固定化原生质体的特点）固定化原生质体的特点1）增加细胞的通透性增加细胞的通透性，利于氧气及营养物质的传递，利于氧气及营养物质的传递和吸收，利于胞内产物的释放，可显著提高产率。和吸收，利于胞内产物的释放，可显著提高产率。2）有）有载体的保护作用载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保，具有

36、较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用或连续使用较长时间，利于存稳定性，可反复使用或连续使用较长时间，利于连续化生产。连续化生产。3）易与发酵产物分开易与发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。高产品质量。4）固定化原生质体发酵的培养基中需添加）固定化原生质体发酵的培养基中需添加渗透压稳渗透压稳定剂定剂，以保持原生质体的稳定性。，以保持原生质体的稳定性。辅酶、细胞及原生质体的固定化方法辅酶、细胞及原生质体的固定化方法辅酶辅酶多采用共价结合法多采用共价结合法细胞细胞吸附法吸附法凝胶包埋法凝胶包埋法原生质体原生质体包埋法包埋法上节课主要内容上节课主要内容固定化

37、酶的性质固定化酶的性质辅酶的固定化辅酶的固定化细胞及原生质体的固定化细胞及原生质体的固定化改变改变可能改变可能改变发生变化发生变化固定化酶的性质固定化酶的性质固定化酶固定化酶活力活力固定化酶的固定化酶的稳定性稳定性固定化酶的固定化酶的最适温度最适温度固定化酶的固定化酶的最适最适pH固定化酶的固定化酶的底物特异性底物特异性固定化酶的固定化酶的米氏常数（米氏常数（Km）活力活力降低降低大多大多提高提高可能可能提高提高载体性质载体性质带负电荷：固定化酶带负电荷：固定化酶pHpH带正电荷：固定化酶带正电荷：固定化酶pHpH产物性质产物性质产物酸性：固定化酶产物酸性：固定化酶pHpH产物碱性：固定化酶产

38、物碱性：固定化酶pHpH产物中性：固定化酶产物中性：固定化酶pHpH不变不变作用于小分子底物的酶作用于小分子底物的酶不变不变可作用于小分子及大分子可作用于小分子及大分子底物的酶改变底物的酶改变载体与底物电荷相反载体与底物电荷相反Km降低降低载体与底物电荷相同载体与底物电荷相同Km升高升高辅酶、细胞及原生质体的固定化方法辅酶、细胞及原生质体的固定化方法辅酶辅酶多采用共价结合法多采用共价结合法细胞细胞吸附法吸附法凝胶包埋法凝胶包埋法原生质体原生质体包埋法包埋法评价固定化酶（细胞）的指标评价固定化酶（细胞）的指标1、固定化酶（细胞）的活力、固定化酶（细胞）的活力2、偶联率及相对活力、偶联率及相对活力

39、3、固定化酶（细胞）的半衰期、固定化酶（细胞）的半衰期 5.5 固定化酶（细胞）的应用固定化酶（细胞）的应用固定化酶在固定化酶在基础理论基础理论研究中应用研究中应用固定化酶和固定化酶和亲和色谱亲和色谱固定化酶（细胞）在固定化酶（细胞）在工农业生产工农业生产上的应用上的应用固定化酶在固定化酶在医药治疗医药治疗上的应用上的应用固定化酶在固定化酶在分析化学分析化学中应用中应用固定化酶与固定化酶与环境保护环境保护固定化酶在固定化酶在新能源开发新能源开发中的应用中的应用1. 在基础理论研究中的应用在基础理论研究中的应用（1）阐明酶反应的机理）阐明酶反应的机理在多酶反应中，将酶固定化后装成酶柱，说明在多酶

40、反应中，将酶固定化后装成酶柱，说明每一个酶的作用。每一个酶的作用。（2）酶亚基性质的研究）酶亚基性质的研究采用固定化方法，控制一定的条件，使多亚基采用固定化方法，控制一定的条件，使多亚基酶中只有一个亚基与载体相连，再通过一定的酶中只有一个亚基与载体相连，再通过一定的方法，除去未被固定的亚基，从而研究单亚基方法，除去未被固定的亚基，从而研究单亚基的性质。的性质。己糖激酶葡萄糖葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸磷酸葡萄糖异构酶磷酸果糖激酶果糖-1,6-二磷酸醛缩酶3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮活化载体活化载体 载载 体体+活化活化+例如：醛缩酶亚基活力的测定例如：醛缩酶亚基活力的测定8mol/L尿素尿素透

41、析透析醛缩酶亚基活力测定醛缩酶亚基活力测定固定化衍生物固定化衍生物活力活力/U蛋白质蛋白质/mg比活力比活力/Umg-1全酶全酶1001004.5亚基亚基9.827.51.6（3）揭示酶原激活机理）揭示酶原激活机理有时酶原激活并不涉及蛋白水解。有时酶原激活并不涉及蛋白水解。如：酪氨酸酶，固定化后，不需水解就可活化至如：酪氨酸酶，固定化后，不需水解就可活化至天然酶活的天然酶活的2030。说明蛋白酶结构重排后可激活酶的一些活力。说明蛋白酶结构重排后可激活酶的一些活力。（4）研究蛋白质）研究蛋白质-核酸分子结构核酸分子结构如：用双功能试剂测定酶侧链基团之间的距离；如：用双功能试剂测定酶侧链基团之间的

42、距离； 用交联法分析寡聚蛋白的四级结构。用交联法分析寡聚蛋白的四级结构。2. 亲和分离系统亲和分离系统（1）生物亲和技术的基础：生物活性化合物特异性）生物亲和技术的基础：生物活性化合物特异性信息的综合。信息的综合。（2）亲和分离）亲和分离 利用生命现象中生物分子间特有的利用生命现象中生物分子间特有的高亲和力高亲和力、高专高专一性一性，可逆结合可逆结合而设计的一种十分巧妙的纯化方法，而设计的一种十分巧妙的纯化方法，是唯一的一种能够体现待分离物质间生物学功能差是唯一的一种能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方法。异的分离方法。（3）亲和分离种类）亲和分离种类1）将某种作为配基的生物分子偶联于固

43、相载体上制）将某种作为配基的生物分子偶联于固相载体上制成亲和吸附剂，用作色谱的填充剂来分离与之特异成亲和吸附剂，用作色谱的填充剂来分离与之特异结合的配体，然后将配体洗脱下来并回收结合的配体，然后将配体洗脱下来并回收-亲和色亲和色谱法。谱法。2）将配基偶联于载体上，用于选择性地去除某些污）将配基偶联于载体上，用于选择性地去除某些污染物。染物。3）将细胞表面抗原分子对应的抗体偶联于载体上用）将细胞表面抗原分子对应的抗体偶联于载体上用于细胞的标记、分离及性质研究。于细胞的标记、分离及性质研究。（4）应用）应用1）物质分离）物质分离2）微量物质的分析）微量物质的分析3）肽库及抗体库的筛选）肽库及抗体库

44、的筛选4）制药工业（亲和色谱用于药用重组蛋白的纯化）制药工业（亲和色谱用于药用重组蛋白的纯化）5）核酸分离（碱基配对）核酸分离（碱基配对）色谱固定化金属离子亲和色谱法纯化猪铜锌超氧化物歧化酶以Cu+-Sepharose 4B固定化金属离子亲和色谱法纯化猪铜锌超氧化物歧化酶，考察丁不同的洗脱缓冲溶液及其pH 对纯化效率的影响，显示了方法的有效性。色谱固定化铜离子亲和膜色谱柱吸附血红蛋白的研究将纤维素滤纸进行碱处理及环氧活化、偶联亚氨基二乙酸、固定化铜离子等处理，并将其装入自制的色谱柱管，制得固定化铜离子亲和膜色谱柱。该柱可用于吸附血红蛋白(hemoglobin，Hb)，吸附率可达到90以上。3.

45、 药物控释载体药物控释载体从从时间时间和和空间空间分布上控制药物的释放。分布上控制药物的释放。（1）一些药物不能用于临床的原因）一些药物不能用于临床的原因1）很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破）很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破坏或沉淀。坏或沉淀。2）单纯注射后瞬时血药浓度提高，但马上被肝脏及）单纯注射后瞬时血药浓度提高，但马上被肝脏及血液中的酶系统所消除，需要反复注射，不仅增加血液中的酶系统所消除，需要反复注射，不仅增加治疗费用，而且增加感染的机会。治疗费用，而且增加感染的机会。3）肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副）肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副作用严重

46、。作用严重。4）有些药物亲水性强，难于穿过细胞膜。）有些药物亲水性强，难于穿过细胞膜。5）蛋白质类药物易引起免疫反应。）蛋白质类药物易引起免疫反应。6）很多药物稳定性差，不耐贮存。）很多药物稳定性差，不耐贮存。药物控制释放技术：将药物或其他的活性物质与适当的载体按一定的形式制成制剂，控制药物在人体内吸收、代谢以及排泄的过程。使药物按设计的剂量，在要求的时间范围内以一定的模式在体内释放或使药物在指定部位释放而达到治疗某种疾病的目的。（2）解决方法）解决方法1）聚合物修饰）聚合物修饰 多用于多用于蛋白质类药物蛋白质类药物。这类药物生物半衰期短，免。这类药物生物半衰期短，免疫性强，可用适当的水溶性高

47、分子聚合物加以修饰疫性强，可用适当的水溶性高分子聚合物加以修饰以改善其性能。以改善其性能。2）凝胶包埋）凝胶包埋 希望药物能够较长时间内维持一个稳定浓度希望药物能够较长时间内维持一个稳定浓度 用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含有药物的凝胶，植入人体内特定部位，以达到缓释有药物的凝胶，植入人体内特定部位，以达到缓释给药效果。给药效果。3）微球制剂）微球制剂 用高聚物微球用高聚物微球包埋包埋或或化学偶联化学偶联药物可制成微球制剂，药物可制成微球制剂，它具有靶向性、缓释性及减少抗药性等特点。微球它具有靶向性、缓释性及减少抗药性等特点。微球与靶细胞

48、接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用，与靶细胞接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用，不影响细胞膜通透性，不会产生抗药性。不影响细胞膜通透性，不会产生抗药性。4）脂质体）脂质体 脂质体是磷脂双分子层在水溶液中自发形成的超微脂质体是磷脂双分子层在水溶液中自发形成的超微型中空小泡，具有靶向性、长效性。并且可以通过型中空小泡，具有靶向性、长效性。并且可以通过胞饮作用胞内释放药物，从而避免抗药性；此外还胞饮作用胞内释放药物，从而避免抗药性；此外还具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且无毒具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且无毒性，无免疫原性。性，无免疫原性。5）导向药物）导向药物 导向药物具有主动靶向

49、性，将针对肿瘤细胞的单克导向药物具有主动靶向性，将针对肿瘤细胞的单克隆抗体与化疗药物化学偶联，可以直接作用于肿瘤隆抗体与化疗药物化学偶联，可以直接作用于肿瘤细胞而产生杀伤作用，并且降低全身毒性。细胞而产生杀伤作用，并且降低全身毒性。高分子通报生物可降解聚酯用作蛋白质药物控释载体聚乳酸PLA及乳酸与羟基乙酸的共聚物PLGA，由于其良好的生物相容性以及生物降解性，可用作蛋白质类药物控释体系的载体材料，同时可延长蛋白质药物的释放。本文综述了几种生物相容性聚酯及其衍生物以及它们的形成方法：(1)在PLGA的分子链中引入亲水性的含醚键的分子如PEO、PEG，来提高聚合物的亲水性，形成PLGA嵌段共聚物；

50、(2)将细胞可接受的片段或多肽固定在聚合物支架表面，来增强PLGA与细胞间的粘附力，得到靶向的PLGA衍生物；(3)改变PLGA载体内的酸性环境，提高蛋白质药物在载体中的稳定性，发展了支化聚酯PVA-g-PLGA，并得到均速的药物释放。以上这些方法所得到的聚酯及其衍生物，均可作为蛋白质类药物安全、可靠的载体材料。4. 生物传感器生物传感器由固定化酶（或细胞、细胞器等）与适当的换能器由固定化酶（或细胞、细胞器等）与适当的换能器（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合而构成的分析系统，由感受器、换能器和电子线合而构成的分析系统，由感受器、换能器和电

51、子线路三部分组成。路三部分组成。应用：葡萄糖氧化酶电极，青霉素酶电极应用：葡萄糖氧化酶电极，青霉素酶电极Pellinen等研究了一种发光的大肠杆菌(Escherichia coli K12)用于测量鱼肉样品中四环素等抗菌素的含量。该生物传感器是将一种带荧光素酶操纵子的质粒导人大肠杆菌中，可检测鱼肉中的四环素和土霉素的浓度，测量极限分别为20 ng kg-1 和50 ng kg-1 。5. 其他方面的应用其他方面的应用（P165-169，172-174，176，178，181）（1）工业催化剂）工业催化剂（2）工程菌的培养）工程菌的培养（3）化学分析和临床诊断）化学分析和临床诊断（4）临床治疗）临床治疗（5）环境中微量有毒物质的含量测定，进行环境监）环境中微量有毒物质的含量测定，进行环境监测测（6）新化学能源的开发）新化学能源的开发 固定化酶在工农业生产上的应用固定化酶