第7章基因的表达与调控(上)

1、第七章第七章原核基因表达调控原核基因表达调控Expression and regulation of Gene in Prokaryotes 概述概述一、基因表达的概念一、基因表达的概念gene expression ：基因转录及翻译的过程。对：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为这个过程的调节就称为gene regulation 。rRNA、tRNA编码基因转录合成编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。的过程也属于基因表达。 组成性表达组成性表达(constitutive expression) 适应性表达适应性表达(adaptive expression）二、基因表达的方式二

2、、基因表达的方式 1、组成型表达：、组成型表达： 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。指不大受环境变动而变化的一类基因表达。某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为通常被称为管家基因管家基因(housekeeping gene)。无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为因，这类基因表达被视为组成型表达组成

3、型表达(constitutive expression)。 2、适应性表达、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。基因表达。n 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导诱导(induction)，这类基因被称为，这类基因被称为可诱导的基因可诱导的基因(inducible gene)；n相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为，相应的基因被称为可阻可阻遏的基因遏的基因(repressibl

4、e gene)。 n在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为，即为协调表达协调表达(coordinate expression)，这种调，这种调节称为协调调节节称为协调调节(coordinate regulation)。三、基因表达的规律三、基因表达的规律 时间性和空间性时间性和空间性1、时间特异性（、时间特异性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表达严格按按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的

5、特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间时间特异性。特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶阶段特异性段特异性(stage specificity)。 2、空间特异性、空间特异性(spatial specificity)基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称所以空间特异性又称细胞或组织特异性细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。在个体生长全过程，某种基因产物在个体在个体生长全过程，某种基

6、因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性空间特异性。四、基因表达调控的生物学意义四、基因表达调控的生物学意义n适应环境、维持生长和增殖适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）（原核、真核）n维持个体发育与分化维持个体发育与分化（真核）（真核）五、基因表达调控的层次五、基因表达调控的层次转录水平转录水平 基因结构活化基因结构活化转录起始（基因表达基本控制点）转录起始（基因表达基本控制点） 转录后水平转录后水平转录后加工转录后加工转录产物的转运转录产物的转运翻译水平翻译水平翻译调控翻译调控翻译后加工翻译后加工蛋白质降解蛋白质降解六、六、转

7、录水平转录水平-基因转录激活调节基本要素基因转录激活调节基本要素 （一）（一） 特异特异DNA序列序列 （二）（二） 调节蛋白调节蛋白 （三）（三） RNA聚合酶聚合酶1. 原核生物的特异原核生物的特异DNA序列序列 原核生物基因表达与调控是通过操纵子机制来实现的。原核生物基因表达与调控是通过操纵子机制来实现的。 操纵子操纵子 是由功能上相关联的多个编码序列（结构基因）及其上游的是由功能上相关联的多个编码序列（结构基因）及其上游的调控序列成簇串联在一起构成的一个转录协调单位。调控序列成簇串联在一起构成的一个转录协调单位。 调控序列调控序列 包括操纵序列包括操纵序列(O)、启动序列、启动序列(P

8、)和调节基因和调节基因(I/R)等组件。等组件。 （一）特异（一）特异DNA序列序列 操纵子操纵子调节基因调节基因 启动序列启动序列 操纵序列操纵序列 编码序列（编码序列（结构基因结构基因） 表达表达 转录转录ICAPPOZYA阻遏蛋白阻遏蛋白结合部位结合部位RNA聚合酶聚合酶结合部位结合部位启动序列（启动序列（P）：）： 其中的其中的-35区区 -10区区是是RNA聚合酶识别并结合的部位。聚合酶识别并结合的部位。 多顺反子多顺反子mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白（负性调节）（负性调节） （ 正性调节）正性调节）多种蛋白质多种蛋白质2. 真核生物的特异真核生物的特异DNA序列序列 真核生物基因组中含有

9、可以调控自身基因表达的真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达的特异特异DNA序列，称为顺式作用元件。序列，称为顺式作用元件。 顺式作用元件能够被各种转录调节蛋白特异识顺式作用元件能够被各种转录调节蛋白特异识别和结合，从而影响基因表达活性。别和结合，从而影响基因表达活性。 启动子启动子 顺式作用元件又分顺式作用元件又分 增强子增强子 沉默子沉默子1) 顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element)可影响自身基因表达活性的可影响自身基因表达活性的DNA序列序列BADNA编码序列编码序列转录起始点转录起始点不同真核生物的顺式作用元件中也会发现不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一

10、些共有序列一些共有序列 ，如，如TATA盒、盒、CAAT盒等，这盒等，这些共有序列是些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的聚合酶或特异转录因子的结合位点。结合位点。（二）调节蛋白（二）调节蛋白1. 原核生物的调节蛋白（原核生物的调节蛋白（3类）类）特异因子特异因子 决定决定RNA聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力；聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力； (如，如，RNA聚合酶的聚合酶的 因子因子)阻遏蛋白阻遏蛋白 通过与操纵序列结合，阻遏基因转录，发挥负性调控作用；通过与操纵序列结合，阻遏基因转录，发挥负性调控作用； （由调节基因表达的阻遏蛋白）（由调节基因表达的阻遏蛋白）激活蛋白激活蛋白

11、 与启动子上游与启动子上游DNA序列结合，促进序列结合，促进RNA聚合酶转录活性，聚合酶转录活性，发挥正性调控作用。发挥正性调控作用。(如，如，CAP分解代谢物基因活化蛋白分解代谢物基因活化蛋白) 2. 真核生物的调节蛋白真核生物的调节蛋白 反式作用因子反式作用因子 能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式（作用）因子。的一类调节蛋白，统称为反式（作用）因子。(trans-acting factor) 按其功能不同，常有以下三类：按其功能不同，常有以下三类： 基本转录因子基本转录因子 转录调节因子转录调节

12、因子 共调节因子共调节因子 （1） 基本转录因子（基本转录因子（TF） 是指能够在启动子部位与核心序列是指能够在启动子部位与核心序列TATA盒和盒和RNA Pol结合，形成转录前起始复合物（结合，形成转录前起始复合物（PIC）的一类调节蛋白，以起）的一类调节蛋白，以起动转录。动转录。 与与RNA聚合酶聚合酶(RNA Pol )结合的结合的(基本基本)转录因子有：转录因子有：TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH, TFJ 等。等。 首先由首先由TFD与启动子与启动子TATA盒结合，然后按一定的时空顺盒结合，然后按一定的时空顺序依次结合序依次结合RNA Pol和其它转录因子，形成和其它转

13、录因子，形成PIC。 (2) (2) 转录调节因子转录调节因子 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点上游的调控序列或远这类调节蛋白能识别并结合转录起始点上游的调控序列或远端的增强子元件，通过蛋白质端的增强子元件，通过蛋白质- -DNA相互作用而影响转录活性。相互作用而影响转录活性。 起激活转录作用起激活转录作用转录激活因子；转录激活因子； 起阻遏转录作用起阻遏转录作用转录阻遏因子。转录阻遏因子。（3 3） 共调节因子共调节因子 另有一类与转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影另有一类与转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，影响转录活性，称共调节因子。响它们的分子构象，影响转

14、录活性，称共调节因子。 如果与转录激活因子有协同作用如果与转录激活因子有协同作用共激活因子；共激活因子； 与转录阻遏因子有协同作用与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。共阻遏因子。7.1原核基因表达调控总论原核基因表达调控总论7.1.1 原核基因表达调控的类型与特点原核基因表达调控的类型与特点1、根据操纵子对调节蛋白、根据操纵子对调节蛋白(阻遏蛋白或激活蛋白阻遏蛋白或激活蛋白) 的应答，的应答，正转录调控正转录调控负转录调控负转录调控调节基因调节基因RNA调节蛋白调节蛋白调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因激活蛋白激活蛋白正转录调控正转录调控正转录调控正转录调控如果在没有调节蛋白质存

15、在时基因是关闭的，加入如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控正转录调控。正转录调控。调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白负转录调控负转录调控负转录调控负转录调控在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。负转录调控。 根据辅因子根据辅因子(小分子小分子)结合后调控效果，可分：结合后调控效果，可分： 开启调控系统中结构基因的转录活性开

16、启调控系统中结构基因的转录活性 诱导诱导关闭调控系统中结构基因的转录活性关闭调控系统中结构基因的转录活性 阻遏阻遏 操纵子调控系统的基本类型操纵子调控系统的基本类型v可诱导负控制系统可诱导负控制系统v可诱导正控制系统可诱导正控制系统v可阻遏负控制系统可阻遏负控制系统v可阻遏正控制系统可阻遏正控制系统几个概念：几个概念：n诱导物诱导物(inducer)：指当作用于细胞群体时指当作用于细胞群体时,通过诱通过诱导机制、能增加特定基因转录的导机制、能增加特定基因转录的mRNA含量的一含量的一种化学因子或物理因子种化学因子或物理因子,n辅阻遏物辅阻遏物(corepressor )：一种能与阻遏蛋白形成一

17、种能与阻遏蛋白形成功能阻遏物，而使合成代谢的操纵子受到阻遏的功能阻遏物，而使合成代谢的操纵子受到阻遏的代谢终产物。代谢终产物。 n正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调控又有负调控；控又有负调控；原核生物以负调控为主，真核生物以正调原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主；控为主；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；降解代谢途径中既有正调控又有负调控；合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。的合成。1.可诱导调节2.可阻遏调

18、节7.1.2 原核基因表达调控的主要特点原核基因表达调控的主要特点7.1.3 弱化子对基因活性的影响弱化子对基因活性的影响7.1.4 降解物对基因活性的影响降解物对基因活性的影响7.1.5 细菌的应急反应细菌的应急反应1、Discovery of Operon n1961年年, F. Jacob & J.Monod提出提出, 此后不断完善。此后不断完善。获获1965年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖n1940年，年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后

19、，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生n细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶n1947年，报告：年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”Francis Jacob Jacques Monod 7.2 乳糖操纵子与负乳糖操纵子与负控诱导系统控诱导系统n1951年，年，Monod与与Jacob合作，发现两对基因：合作，发现两对基因：Z基因基因：与合成：与合成-半乳糖苷酶有关；半乳糖苷酶有关；I基因基因：决定细胞对诱导物的反应。：决定细胞对诱导物的反应。nSzil

20、ard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。该阻遏物。n Jacob：结构基因旁有开关基因（：结构基因旁有开关基因（操纵基因操纵基因），），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。表达。n操纵子操纵子是一种完整的具有特定功能的细菌基因是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括表达和调节的单位，包括调节基因调节基因，操纵位点操纵位点，结构基因结构基因，组成一个控制单元。，组成一个控制单元。 结构基因：结构基

21、因：产生产生mRNA,合成蛋白质合成蛋白质 操纵位点操纵位点 operator：启动子结合位点：启动子结合位点 调节基因：产生调节蛋白调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）（与操纵位点结合） 结构基因不转录结构基因不转录 诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合 结构基因转录结构基因转录2、操纵子的定义、操纵子的定义7.2.1 酶的诱导酶的诱导lac体系受调控的证据体系受调控的证据n细菌对乳糖的利用及其相关的酶细菌对乳糖的利用及其相关的酶: 乳糖乳糖 (在通透酶作用下进入细菌）在通透酶作用下进入细菌） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 别构乳糖别构乳糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 葡萄

22、糖葡萄糖+半乳糖半乳糖 -半乳糖苷乙酰基转移酶半乳糖苷乙酰基转移酶1) lac操纵子的本底水平操纵子的本底水平(basal level)表达表达有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的：有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成有需要诱导。需要透过酶，后者的合成有需要诱导。真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的半乳糖甘酶的预先存在。预先存在。

23、 一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？ 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？解释：解释：本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。合成。分解底物的酶只有在分解底物的酶只有在底物存在时才出现！底物存在时才出现！n无乳糖时，几个无乳糖时，几个b b-gal/cell 加入乳糖时，加入乳糖时，5000个个 n乳糖的诱导作用是由酶前体乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合转化而来，还是诱导新酶合成？成？ 培养基（培养基（35S-aa, 无乳糖

24、）无乳糖） E. coli繁殖繁殖 培养基（无培养基（无35S -aa, 加入乳加入乳糖）糖） -gal(无无35S)大肠杆菌对乳糖的反应大肠杆菌对乳糖的反应 培养基：甘油培养基：甘油 按照按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的分子的-半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶；半乳糖苷透过酶；培养基：加入乳糖培养基：加入乳糖少量乳糖少量乳糖透过酶透过酶进入细胞进入细胞-半乳糖苷酶半乳糖苷酶异构乳糖异构乳糖诱导物诱导物诱导诱导lac mRNA的生物合成的生物合成大量乳糖进入细胞大量乳糖进入细胞多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）多数被降解

25、为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）异构乳糖异构乳糖乙酰基转移酶乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶操纵位点操纵位点调节基因调节基因7.2.2 lac Operon的模型及其影响因子的模型及其影响因子nZ编码编码-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖半乳糖nY编码编码-半乳糖苷透过酶：半乳糖苷透过酶：使外界的使外界的-半乳糖半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。膜进入细胞内。nA编码编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶乙酰辅酶A上的乙酰基转到上的乙酰基转到-

26、半乳糖苷上，形成乙酰半乳半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。糖。mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时没有乳糖存在时阻遏蛋白的调节阻遏蛋白的调节阻遏基因阻遏基因1.乳糖操纵子调控模型乳糖操纵子调控模型mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在时有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录启动转录mRNA乳糖乳糖别构乳糖别构乳糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶（1）mRNA分子的启动子紧接着分子的启动子紧接着O区，而位于区，而位于I与与O之间之间的启动子区的启动子区(P)，不能单独起动合成，不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。过酶的生理过程。2. 乳糖操纵子调控机制乳糖

27、操纵子调控机制阻遏物阻遏物lac I基因产物及功能基因产物及功能 lac 操纵子阻遏物操纵子阻遏物mRNA是是由弱启动子控制下组成型合成由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有的，每个细胞中有5-10个阻遏个阻遏物分子。物分子。 当当I基因由弱启动子基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个阻遏状态，整个lac操纵子在操纵子在这些突变体中就不可诱导。这些突变体中就不可诱导。RNA聚合酶结合部位聚合酶结合部位阻遏物结合部位阻遏物结合部位（2）操纵基因是）操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为上的一小段序列（

28、仅为26bp），是阻），是阻遏物的结合位点。遏物的结合位点。操纵位点的回文序列操纵位点的回文序列 未诱导：结构基因被阻遏 阻遏物 四聚体 LacI P O lacZ lacY lacA 图 16- 当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上 （3）当阻遏物与操纵基因结合时，）当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起的转录起始受到抑制。始受到抑制。（4）诱导物通过与阻遏物）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，使之不能与操纵基因结合，从而激发从而激发lac mRNA的合的合成。当有诱导物存在时，成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物操纵

29、基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺占据，所以启动子能够顺利起始利起始mRNA的合成。的合成。 阻遏蛋白单体的结构阻遏蛋白单体的结构 Helix-turn-helix Core domain1 Core domain2 1 51 80 360 DNA binding Hinge Inducer binding Oligomerization 图 16- 阻遏蛋白单体的结构和功能阻遏蛋白单体阻遏蛋白单体的三级结构的三级结构 Active repressor cannot bind to O c mutant operantor Operon is transcribed and transl

30、ated lacI O c operantor -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰转移酶 图 16-7 操纵基因发生组成型突变，操纵子组成型表达 乳糖乳糖（5）诱导物不是乳糖）诱导物不是乳糖乳糖代谢乳糖代谢生成生成lac诱导物诱导物Allolctose 异构乳糖异构乳糖 别构乳糖别构乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶nIPTG，异丙基，异丙基- D-硫代硫代半乳糖苷半乳糖苷nTMG ，巯甲基半乳糖苷，巯甲基半乳糖苷nONPG, O-硝基半乳糖苷硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖在研究诱导作用时，很少使用乳糖安慰诱导物安慰诱导物(gratuitous inducer)： 如果某种物质能够促使细菌产如果某

31、种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，种物质被称为安慰诱导物，如如:-complementation lacZM15 基因是缺失了编基因是缺失了编码码 -半乳糖苷酶中第半乳糖苷酶中第 11-41 个个氨基酸的氨基酸的 lacZ 基因，无酶学基因，无酶学活性。对于只编码活性。对于只编码 N-端端 140 个氨基酸的个氨基酸的 lacZ 基因基因 （称为（称为 lacZ） ，其产物也没有酶学，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢产物混合在一起时，可恢复复 -半乳糖苷酶的活性，实半乳糖苷酶的活

32、性，实现基因内互补。现基因内互补。在在 lacZ 编码区上游插入一小编码区上游插入一小段段 DNA 片段（如片段（如 51 个碱基个碱基对的多克隆位点），不影响对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该但是，若在该 DNA 小片段中小片段中再插入一个片段，将几乎不可再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无避免地导致产生无-互补能力互补能力的的 -半乳糖苷酶片段。利用半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，质粒。在相应的载体系统中，lacZ

33、M15 放在放在 F 质粒上质粒上, 随随宿主传代；宿主传代； lacZ 放在载体上放在载体上, 作为筛选标记。作为筛选标记。XL1-Blue菌株基因型：菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+ lacIq (lacZ)M15 hsdR17(rK- mK+)+ glucose- glucoseTime (hr)Units of b-galactosidase+ lactoseGlucose added（6）葡萄糖对）葡萄糖对lac操纵子的影响操纵子的影响代谢物阻遏效应代谢物阻遏效应实验，在实验，在Lac

34、Glu培养基上培养基上 E.coli只利用只利用G，只有，只有G 耗尽时，才会利用耗尽时，才会利用lacn葡萄糖抑制葡萄糖抑制lac mRNA的转录：的转录： 可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应，仅去掉可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应，仅去掉阻遏物并不能启动阻遏物并不能启动lac基因表达基因表达,有其它因素参与有其它因素参与分解代谢阻遏分解代谢阻遏(catabolite repression)n只有当以乳糖为唯一碳源时，只有当以乳糖为唯一碳源时，-半乳糖苷酶的合成才增半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，-半乳糖苷酶的合

35、成速率也会大大提高，可达到只用半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。这说明，乳糖为碳源时的水平。这说明，cell内内cAMP的浓度能影的浓度能影响到响到-半乳糖苷酶的合成速率。半乳糖苷酶的合成速率。n葡萄糖对葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的操纵子表达的抑制是间接的 ATP腺甘酸环化酶腺甘酸环化酶cAMP（环腺甘酸）（环腺甘酸） 大肠杆菌中：无葡萄糖，大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高；浓度高； 有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低浓度低cAMP（环化腺苷一磷酸，（环化腺苷一磷酸，cyclic AMP）1965年，年，B. Magasonik发现在大肠杆菌中也含有

36、发现在大肠杆菌中也含有cAMP，而且菌株内而且菌株内cAMP的含量常随细胞的生理状态发生变化，的含量常随细胞的生理状态发生变化，即当细胞处于碳源饥饿条件下，即当细胞处于碳源饥饿条件下，cAMP水平显著提高，水平显著提高，反之在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，反之在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，cAMP水平明显降低；水平明显降低；腺苷环化酶腺苷环化酶腺苷酸环化酶位于细胞膜上，腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此关，因此cAMP调控乳糖、调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等其他糖半乳糖、阿拉伯糖等其他糖类代谢有关的酶。类代谢有关的酶。 n葡萄糖的降解

37、是通过葡萄糖的降解是通过cAMP与与 CAP结合起作用。结合起作用。 CAP, catabolite activator protein，由由crp编码编码CRP, catabolite receptor protein代谢物激活蛋白（代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（环腺甘酸受体蛋白（CRP）CAP激活转录激活转录? （1）可能直接和）可能直接和RNA Pol相互作用；相互作用； （2）作用于）作用于DNA，改变其结构，从而帮助，改变其结构，从而帮助RNA Pol结合。结合。CAP结合位点结合位点nCAP为二聚体，为二聚体， 45KD ，被，被cAMP激活激活n结合位点结合位点22

38、bp I -70 -50 II -50 -40CAP的结合对的结合对DNA构型的影响构型的影响nDNA弯曲弯曲n弯曲点位于弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心结合位点二重对称的中心n弯曲使弯曲使CAP能与启动子上的能与启动子上的RNA pol 接触接触+ + + + 转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低时浓度低时不促进转录不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控的正调控当阻遏蛋白封闭转录时，当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用对该系统不能发挥作用如无如无CAP存在，即使没有阻遏蛋

39、白与操纵序列结合，存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。操纵子仍无转录活性。 cAMPCAP复合物与启动复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。子区的结合是转录起始所必需的。协调调节协调调节葡萄糖对葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称操纵子的阻遏作用称分解代分解代谢阻遏谢阻遏(catabolic repression)。 单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。利用葡萄糖。ZYAOPDNA 调控区调控区CAP结合位点结合位点启动序列启动序列操纵

40、序列操纵序列 结构基因结构基因Z： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y： 通透酶通透酶A：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶cAMPCAP复合物复合物The lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCome on, let me throughNo wayJose!CAPThe Lac Operon:When Glucose And L

41、actose Are PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPLacRepressorRepressorXRNAPol.RNAPol.Great, I can transcribe!Some transcription occurs, but at a slow rateThis lactose has bent me out of shapeThe lac Operon:When Lactose Is Present But

42、Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee!The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoter

43、LacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!Summary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of lac mRNAHighLowP

44、resentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthigh rate of expressionlac operon 的其它问题的其它问题1lac operon的功能是在的功能是在正负正负两个调控体系的协调作用两个调控体系的协调作用(coordinate regulation)下实现的。下实现的。阻遏蛋白封闭转录时，阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；如没有不发挥作用；如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋加强转录，即使阻遏蛋白从白从P上解聚仍无转录

45、活性上解聚仍无转录活性nCAP组成型合成，所以组成型合成，所以cAMPCAP复合物取决于复合物取决于cAMP含量含量n腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此酶有关，因此cAMPCAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶糖等糖类代谢有关的酶n降解物敏感型操纵子：只要有葡萄糖存在，这些操纵降解物敏感型操纵子：只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达子就不表达2. A基因及其生理功能基因及其生理功能 编码编码b-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代

46、谢！该酶不参与乳糖代谢！ 生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒. 所以所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累物质的积累3. lac基因产物数量基因产物数量， 1：0.5：0.2 不同酶的数量差异不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节是由于在翻译水平上的调节. 方方式有二：式有二：核糖体脱离；核糖体脱离；多顺反子的差

47、别性翻译多顺反子的差别性翻译 内切酶作用内切酶作用: 在在lac mRNA分子内部，分子内部，a基因比基因比z基基因更易受内切酶作用因更易受内切酶作用总结总结-乳糖操纵子的作用机制乳糖操纵子的作用机制1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子，一个启动子P和一个和一个调节基因调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码

48、的阻基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正调节：在启动子上游有的正调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境

49、转变为以乳糖为碳源的环境杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，时，cAMP浓度升高，与浓度升高，与CAP结合，使结合，使CAP发生变构，发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激结合位点，激活活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调基因编码

50、的阻遏蛋白的负调控与控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。的正调控两种机制，互相协调、互相制约。总结总结-乳糖操纵子的作用机制乳糖操纵子的作用机制7.4 其他操纵子其他操纵子Galactose OperonArabinose Operon7.4.1半乳糖操纵子半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括包括3个结构基因：个结构基因： n异构酶异构酶(UDP-galactose-4epimerase, galE)，n半乳糖半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)n半乳糖激酶

51、半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。Map of the E. coli gal operon and nucleotide sequence of the regulatory region 3个酶的作用：使半乳糖变成葡萄糖个酶的作用：使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。磷酸。galR与与galE、T、K及操纵区及操纵区O等离得很远，而等离得很远，而galR产物对产物对galO的作用与的作用与lacI-lacO的的作用相同。作用相同。gal操纵子的特点：操纵子的特点：n 它有两个启动子，其它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点可从两个不同的起始点开始转录；开始转录；

52、n 它有两个它有两个O区，一个在区，一个在P区上游区上游-67-53，另一个在结，另一个在结构基因构基因galE内部。内部。CAP, catabolite activator protein，由由crp编码编码CRP, catabolite receptor protein代谢物激活蛋白（代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（环腺甘酸受体蛋白（CRP）n因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，在时，gal操纵子仍可被诱导。操纵子仍可被诱导。

53、n现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构结构基因高效表达）；基因高效表达）；n而另一类突变株中而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。，不合成半乳糖代谢酶类。n分析分析gal操纵子操纵子P-O区的区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅仅5bp的启动子，可以分

54、别起始的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各的合成。每个启动子拥有各自的自的RNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点S1和和S2。n从从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与聚合酶与S1的结合需要半乳糖、的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的和较高浓度的cAMP。n从从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制能抑制由这个启动子起始的转录。当有由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从时，转录从S1开始，当开始，当无无cAMP-CAP时

55、，转录从时，转录从S2开始。开始。1. cAMP-CRP对对gal启动子的作用启动子的作用为什么为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？操纵子需要两个转录起始位点？n半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质关的物质-尿苷二磷酸半乳糖（尿苷二磷酸半乳糖（UDP-gal）是大肠杆菌细）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，葡萄糖合成的，该酶是该酶是galE基因的产物。基因的产物。n异

56、构酶异构酶(UDP-galactose-4epimerase, galE)，n 生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。构酶。n 假如唯一的启动子是假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是

57、一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（的启动子（S1）对高水平合成进行调节。）对高水平合成进行调节。 在在E. coli中阿拉伯糖的降解需要中阿拉伯糖的降解需要3个基因：个基因：araB、araA和和araD，形成，形成一个基因簇，简写为一个基因簇，简写为araBAD 分别编码阿拉伯糖代谢需要的三种酶：分别编码阿拉伯糖代谢需要的三种酶：核酮糖激酶（核酮糖激酶（ribulose kinase），），阿拉伯糖异构酶阿拉伯糖异构酶（arabinose isomerase） 核酮糖核酮糖-5-磷酸差向异构酶磷酸

58、差向异构酶(ribulose-5-phosphate eimerase)7.4.2 阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖操纵子 araBAD和和araC基因的转录是以相反的方向进行的。在标基因的转录是以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，准的遗传学图谱上，araBAD基因簇从启动子基因簇从启动子PBAD开始向右进开始向右进行转录，而行转录，而araC基因则是从基因则是从Pc向左转录。向左转录。复合启动子区主要有：复合启动子区主要有：1、PBAD区：区：Ara BAD启动子区启动子区2、araC位点：位点：C蛋白蛋白阿拉伯糖复合物与操纵子结合区阿拉伯糖复合物与操纵子结合区3、-280区：是区：是C蛋白与操

59、纵子结合区蛋白与操纵子结合区结构结构:具有正负调节功能的操纵子具有正负调节功能的操纵子与与araB、araA和和araD这这3结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基结构基因相邻的是一个复合启动子区和一个调节基因因C，由调节基因，由调节基因C合成的合成的AraC蛋白是一个自我调节蛋白蛋白是一个自我调节蛋白(autoregulated protein)，它既是，它既是ara操纵子的正调节蛋白，又是操纵子的正调节蛋白，又是ara操纵子的负调节蛋白。操纵子的负调节蛋白。1. 阿拉伯糖操纵子的调节机制阿拉伯糖操纵子的调节机制nara操纵子的调控有三个特点：操纵子的调控有三个特点：n第一，第一，ar

60、aC表达受到表达受到AraC的自动调控。的自动调控。n第二，第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。既可充当阻遏物，也可作为激活剂。n第三，第三，AraC与与CAP结合可充分诱导结合可充分诱导ara操纵子。操纵子。n AraC蛋白作为蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的通过该蛋白的两种异构体两种异构体来实现的。来实现的。Pr是起阻遏作用是起阻遏作用的形的形式，而式，而Pi是起诱导作用是起诱导作用的形式，它通过与的形式，它通过与PBAD启动子结合启动子结合进行调节。进行调节。n 在没有阿拉伯糖时，在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿