生化课件第五章酶

1、第五章第五章酶酶enzyme蛋白质的一个重要生理功能是在生物体新陈代谢中作为生物催化蛋白质的一个重要生理功能是在生物体新陈代谢中作为生物催化剂剂酶，生物体除了抗体酶和核酸酶以外几乎所有的酶都是酶，生物体除了抗体酶和核酸酶以外几乎所有的酶都是蛋白质。生物体新陈代谢过程中所有的生化反应都是在酶的作蛋白质。生物体新陈代谢过程中所有的生化反应都是在酶的作用下进行的，没有酶生物体的新陈代谢无法进行，更不能有序用下进行的，没有酶生物体的新陈代谢无法进行，更不能有序地进行。地进行。一一.酶概念的建立酶概念的建立1.我国对酶的认识：比西方早得多。夏禹时代，周代，春秋战国时我国对酶的认识：比西方早得多。夏禹时代

2、，周代，春秋战国时代。代。2.西方对酶的认识：西方对酶的认识：1857年巴斯德认为发酵是酵母细胞活动的结果。年巴斯德认为发酵是酵母细胞活动的结果。Liebig提出发酵是由于细胞液中的酶引起。提出发酵是由于细胞液中的酶引起。1913年年Michaelis和和Menten提出米氏学说。提出米氏学说。3.1878年提出了酶这个名称。年提出了酶这个名称。1926年年Summer第一次从刀豆中提取第一次从刀豆中提取了脲酶结晶。了脲酶结晶。30年代年代Northrop分离出结晶的胃蛋白酶，胰蛋白分离出结晶的胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，确立了酶的蛋白质本质。酶和胰凝乳蛋白酶，确立了酶的蛋白质本质。4.

3、核酸酶和抗体酶。核酸酶和抗体酶。二二.酶学发展动态酶学发展动态1.目前已经鉴定出了目前已经鉴定出了3000多种酶，其中不少已得到结晶。多种酶，其中不少已得到结晶。2.人们已经弄清了溶菌酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶等酶的结构和人们已经弄清了溶菌酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶等酶的结构和作用机理。作用机理。3.1979年年Kakudo弄清了曲霉中的多元淀粉酶的空间结构。弄清了曲霉中的多元淀粉酶的空间结构。4.目前酶学研究领域目前酶学研究领域1）进一步发现新酶，并尽量得到结晶。）进一步发现新酶，并尽量得到结晶。2）酶的结构与功能的研究。）酶的结构与功能的研究。3）酶作用机理的研究。）酶作用机理的研究。4）酶催

4、化反应的动力学研究。）酶催化反应的动力学研究。5）酶在代谢中的地位及生物合成的遗传机理。）酶在代谢中的地位及生物合成的遗传机理。6）酶系统的自我调节性质。）酶系统的自我调节性质。7）酶在细胞分化过程的作用。）酶在细胞分化过程的作用。8）酶工程研究。）酶工程研究。9）酶的应用开发研究。）酶的应用开发研究。三三.酶的应用酶的应用1.利用酶工程生产生物制品利用酶工程生产生物制品2.工业上的应用：淀粉酶，蛋白酶，脱脂酶，纤维素工业上的应用：淀粉酶，蛋白酶，脱脂酶，纤维素酶。酶。3.医药上的应用：酶进行治疗化验。医药上的应用：酶进行治疗化验。4.农业上的应用：利用酶的抑制剂生产杀虫剂和除草农业上的应用：

5、利用酶的抑制剂生产杀虫剂和除草剂。剂。第一节第一节酶学概论酶学概论一、一、酶的概念及其作用特点酶的概念及其作用特点1、酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。生物催化剂 ：酶(enzyme 核酶(ribozyme) 脱氧核酶(deoxyribozyme) 抗体酶2、酶与非生物催化剂相比的几点共性：酶与非生物催化剂相比的几点共性：催化效率高，用量少（细胞中含量低）。加快反应速度但不改变化学反应平衡点。降低反应活化能。反应前后自身结构不变。催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行。途径进行。催化

6、剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。（化学平衡）。3.酶催化反应的特点即作为生物催化剂的特点酶催化反应的特点即作为生物催化剂的特点（1）、）、催化效率更高催化效率更高酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。转换数（TN)或催化常数（Kcat)表示酶的最大最大催化效率Kcat是一定条件下（SKm）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat =K3） 4231KKEPKESKSE王镜岩p322表8-2 一些酶的最大转换数。碳酸酐酶为600000，

7、溶菌酶为0.5（2）.专一性高专一性高酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。一种酶只作用于一种底物或一类底物。（3）、）、反应条件温和反应条件温和常温、常压，中性pH环境。（4）、）、活性可调节活性可调节别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。从而调节新陈代谢有序进行。（5）、）、酶的催化活性与辅酶、辅基、金属离子有关酶的催化活性与辅酶、辅基、金属离子有关（6）.酶易失活：一般催化剂因中毒而失活，酶容易变酶易失活：一般催化剂因中毒而失活，酶容易变性而失活。因而，酶作用一般要求比较温和的条件。性而失活。因而，酶作用一般要求比较温和的条件。二、二、酶的化学本质及其组成酶

8、的化学本质及其组成（一）（一）酶的化学本质酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质绝大多数酶是蛋白质证据（1）酸水解的 产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活，（2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应）少数酶是少数酶是RNA或或DNA（核酶和脱氧核酶）核酶和脱氧核酶）ribozyme核酶核酶（具有催化功能的（具有催化功能的RNA）（1）80年代初，Thomas Cech和Sidney Altman四膜虫L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前体的剪接 （2）1983年 Atman和Pace E.Coli RNase P中的RNA具有加工tRNA前体的催化功能

9、脱氧核酶脱氧核酶(deoxyribozyme)：具有催化功能的具有催化功能的DNA。20世纪世纪90年代中后期发现。年代中后期发现。抗体酶抗体酶1.定义：利用某种酶底物类似物（半抗原）对动物进行定义：利用某种酶底物类似物（半抗原）对动物进行免疫，使动物产生相应抗体，这种抗体又具有相应酶免疫，使动物产生相应抗体，这种抗体又具有相应酶的功能，叫抗体酶。的功能，叫抗体酶。2.举例：利用酯酶水解产物中的过渡态物质磷酸酯类似举例：利用酯酶水解产物中的过渡态物质磷酸酯类似物免疫动物，使动物产生单克隆抗体，发现这种抗体物免疫动物，使动物产生单克隆抗体，发现这种抗体具有酯酶的活性。这个抗体酶服从米氏动力学。但

10、具有酯酶的活性。这个抗体酶服从米氏动力学。但Km,Kcat,KcatKm,比真正的酯酶少三个数量级。但比真正的酯酶少三个数量级。但能使酯的水解速度提高能使酯的水解速度提高1000倍。这个磷酸酯类似物是倍。这个磷酸酯类似物是其竞争性抑制剂。其竞争性抑制剂。3.应用以及意义：用于开发可切割病毒，肿瘤等具催化应用以及意义：用于开发可切割病毒，肿瘤等具催化活性的抗体酶；开发天然酶不能催化的反应的抗体酶。活性的抗体酶；开发天然酶不能催化的反应的抗体酶。（二）（二）酶的化学组成酶的化学组成单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等结合酶类（conjug

11、ated enzyme):全酶（holoenzyme)=脱辅基酶蛋白（apoenzye)+辅助因子(cofactor)：例如：超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物金属离子：金属离子：Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn2+、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等。等。有机化合物：有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等生物素，卟啉等辅酶辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。与酶蛋白结合较松，可透析除去。辅基辅基(prostheticgr

12、oup)：与酶蛋白共价结合较紧，不易透与酶蛋白共价结合较紧，不易透析除去。析除去。P102表4-1 金属离子作为一些酶的辅助因子P102表4-2 基团转移反应中的辅酶和辅基。酶蛋白决定酶专一性，辅助因子的功能是传递电子、原子或某些功能基团的作用，决定酶促反应的类型和反应的性质。NAD+构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶的辅基。三、三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体1、单体酶单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子牛胰RNase 124aa 单链鸡卵清溶菌酶 129aa 单链胰凝乳蛋白酶 三条肽链等水解酶。2.寡聚酶

13、：即为寡聚蛋白质，由几个甚至几十个亚寡聚酶：即为寡聚蛋白质，由几个甚至几十个亚基组成。基组成。含相同亚基的寡聚酶：苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基含不同亚基的寡聚酶：琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。3、多酶复合体多酶复合体1.定义：由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，定义：由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。成一个代谢途径

14、或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶（E1）以二聚体存在以二聚体存在29600二氢硫辛酸转乙酰基酶（二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000 二 氢 硫 辛 酸 脱 氢 酶 （二 氢 硫 辛 酸 脱 氢 酶 （ E3） 以 二 聚 体 存 在以 二 聚 体 存 在25600012个个E1二聚体二聚体249600024个个E2单体单体24700006个个E3二聚体二聚体1256000总分子量：总分子量：560万万4、多酶融合体（多功能酶）多酶融合体（多功能酶）一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往一条

15、多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。往是基因融合的产物。例如：天冬氨酸激酶例如：天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功融合体（双功能酶）能酶）该酶是四聚体该酶是四聚体4，每条肽链含两个活性区域：每条肽链含两个活性区域：N-端区域端区域是是Asp激酶，激酶，C端区域是高端区域是高Ser脱氢酶脱氢酶第二节第二节酶的分类及命名酶的分类及命名一、一、习惯命名法习惯命名法1.依据底物来命名（绝大多数酶）：依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶蛋白酶、淀粉酶2.依据催化反应的性质命名：依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶水解酶、转氨酶3结合上述两个原则

16、命名：琥珀酸脱氢酶。结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。4.有时加上酶的来源有时加上酶的来源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶二、二、国际系统命名国际系统命名基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。（底物为水时可略去不写）。酶国际系统命名法举例：酶国际系统命名法举例：谷丙转氨酶的系统名称：谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基酮戊二酸氨基转移酶转移酶国际系统分类法及编号（国际系统分类法及编号（EC编号）编号）（1）按反应性质分六大类，用）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。表示。（2

17、）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用分为若干个亚类，编号用1、2、3。（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。表示。每一个酶的编号由每一个酶的编号由4个数字组成，中间以个数字组成，中间以“”隔开。隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚示亚-亚类，第四个数字表示在亚亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。亚中的编号。乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶EC1.1.1.1，乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶EC1.1.1.27

18、，苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37第一个数字表示大类：第一个数字表示大类：氧化还原氧化还原第二个数字表示反应基团：醇基第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：第三个数字表示电子受体：NAD+或或NADP+第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。三三.酶的国际系统分类酶的国际系统分类分为六类：氧、转、水、分为六类：氧、转、水、裂、异、合裂、异、合1、氧化还原酶类氧化还原酶类催化氧化还原反应：催化氧化还原反应：A2H+B=A+B2H乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶（氧化还原酶（EC1.1.1.27），），习惯名：乳酸脱氢酶习惯名

19、：乳酸脱氢酶2、转移酶类转移酶类AB+C=A+BCAla：酮戊二酸氨基移换酶（酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2），），习惯名：习惯名：谷丙转氨酶谷丙转氨酶3、水解酶类水解酶类催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。亮氨酸氨基肽水解酶（亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1），），习惯名：习惯名：Ile氨肽酶。氨肽酶。4、裂合酶类（裂解酶）裂合酶类（裂解酶）催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应反应二磷酸酮糖裂合酶（二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），），习惯名：醛缩酶习惯

20、名：醛缩酶5、异构酶异构酶催化同分异构体相互转化催化同分异构体相互转化6-磷酸磷酸Glc异构酶异构酶6、合成酶（连接酶）合成酶（连接酶）催化一切必须与催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。质合成一种物质的反应。UTP：氨连接酶（氨连接酶（CTP合成酶）合成酶）L-酪氨酸：酪氨酸：tRNA连接酶（酪氨酰连接酶（酪氨酰tRNA合成酶）合成酶）T4DNA连接酶连接酶国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异织差异SOD：EC1.15.1.1，只有一个名称和编号只有一个名称和编号2O2-+2H+H2O2+O2三类不

21、同的三类不同的SOD：CuZn-SOD真核生物细胞质中真核生物细胞质中Mn-SOD真核生物线粒体中真核生物线粒体中Fe-SOD同是同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。结构也有很大不同。在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。加以说明。第三节第三节酶的活力测定与分离纯化酶的活力测定与分离纯化一一、酶活力与酶促反应速度酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度即酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度即能力（一般测初速度，避免了各种干扰）。用来

22、测定能力（一般测初速度，避免了各种干扰）。用来测定酶量的大小。酶量的大小。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度产物的增加量。单位：浓度/单位时间单位时间关系：酶反应速度越快，酶活力越高；反之则越低。关系：酶反应速度越快，酶活力越高；反之则越低。 研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消底物消耗耗5%）。二二、酶的活力单位（酶的活力单位（U）国际单位（国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的

23、酶量，称一个国际单位底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），），1IU=转化转化1umol底物的酶量底物的酶量/min国际单位（国际单位（Katal,Kat单位）：单位）：在最适反应条件下，每秒钟催化在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所底物转化为产物所需的酶量，称需的酶量，称Kat单位单位实际工作中可以根据需要自己规定。实际工作中可以根据需要自己规定。最适条件：最适温度（最适条件：最适温度（25或或37）,最适最适pH、最适缓、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度底物浓度（1）通常很大，使酶饱和通常很大，使酶饱和（2）底物消耗）底物消

24、耗5%sucroseV零级反应enzymeV一级反应但是实际工作中可以根据需要自己规定。但是实际工作中可以根据需要自己规定。例如：限制性核酸内切酶例如：限制性核酸内切酶3种定义：种定义：用粘度法测活性：用粘度法测活性：30，1分钟，使底物分钟，使底物DNA溶液的溶液的比粘度下降比粘度下降25%的酶量为的酶量为1个酶单位。个酶单位。转化率法：转化率法：5分钟使分钟使1ug供体供体DNA残留残留37%的转化活的转化活性所需的酶量为性所需的酶量为1个酶单位。个酶单位。凝胶电泳法测活：凝胶电泳法测活：37，1小时，使小时，使1ugDNA完全水完全水解的酶量为解的酶量为1个酶单位。个酶单位。淀粉酶两种定

25、义：淀粉酶两种定义：A：1g可溶性可溶性starch，在在1h内液化所需的内液化所需的enzyme量。量。B：lml2%可溶性可溶性starch，在在1h内液化所需的内液化所需的enzyme量。量。1g酶制剂溶于酶制剂溶于1000mlH2O，取取0.5ml与与2%的的starch20ml反应，反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。分钟完全液化，求酶活力。A：202%1/0.5100060/10=4800u/克克enzyme制剂制剂B：20/0.5100060/10=240000u/克克enzyme制剂制剂三三.酶的比活力酶的比活力Specificactivity定义：每毫克酶蛋白所具有

26、的酶活力。定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：单位：U/mg蛋白质。有时也用每克酶制剂或每毫蛋白质。有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂所具有的酶活力。升酶制剂所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。一个酶的分离纯化分为4 步。步骤 1 2 3 4总活力（U） 6 4 3 2总蛋白质（mg） 20 10 5 2比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数： 酶的回收率： 100%第一步总活力每一步比活力第一步总活力每一步总活力四、酶活力的测定方法四、酶活力的测

27、定方法酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度或产物的增加量。单位：浓度/单位时间。测量初速单位时间。测量初速度。度。利用底物或产物的理化性质而分别采样不同的方法，利用底物或产物的理化性质而分别采样不同的方法，哪个容易就测哪个。具体方法有：哪个容易就测哪个。具体方法有：分光光度法分光光度法荧光法荧光法同位素法同位素法电化学法电化学法化学滴定法等化学滴定法等五五.酶的分离纯化酶的分离纯化1.分离纯化的方法及操作步骤跟蛋白质相似。分离纯化的方法及操作步骤跟蛋白质相似。2.注意事项：注意事项：1）一般操作应在低温下进行）一

28、般操作应在低温下进行05度；度；2）防止重金属使酶失活，加入鳌合剂防止重金属使酶失活，加入鳌合剂EDTA;3）防止含巯防止含巯基的酶失活，常加入巯基乙醇；基的酶失活，常加入巯基乙醇；4）常不断测定酶的比）常不断测定酶的比活力即不断测酶的纯度，指导提纯工作正确进行，直活力即不断测酶的纯度，指导提纯工作正确进行，直到得到纯酶。到得到纯酶。3.保存：浓缩结晶的酶在保存：浓缩结晶的酶在20度以下保存；不能结晶度以下保存；不能结晶的酶采样以下方法：的酶采样以下方法：1）保存浓缩的酶液，用硫酸氨沉）保存浓缩的酶液，用硫酸氨沉淀或反透析浓缩；淀或反透析浓缩；2）冰冻干燥，制成酶干粉；）冰冻干燥，制成酶干粉；

29、3）浓）浓缩液加入等体积甘油后，在缩液加入等体积甘油后，在20度以下保存。度以下保存。第四节第四节酶促反应动力学酶促反应动力学内容：研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各内容：研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素包括种因素包括底物浓度、酶浓度、底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂温度、激活剂与抑制剂等。与抑制剂等。意义：在酶的结构和功能的关系研究以及酶的作用机理意义：在酶的结构和功能的关系研究以及酶的作用机理的研究中，以及为了解酶在代谢中的作用和酶在某些的研究中，以及为了解酶在代谢中的作用和酶在某些药物中的作用机理等，都需要了解掌握酶促反应的规药物中的作用机理等，都需要了解掌握

30、酶促反应的规律，因此，酶促反应动力学是酶学研究中一个既有理律，因此，酶促反应动力学是酶学研究中一个既有理论意义又具实践意义的重要课题。论意义又具实践意义的重要课题。一、化学动力学基础（自学）一、化学动力学基础（自学）二、二、底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响（条件：单底物单产物酶促反应）（条件：单底物单产物酶促反应）（一）（一）中间复合物假说与米式方程中间复合物假说与米式方程1903 Henri sucrose + H2Oglucose + fructoseacidVsucroseenzymeVsucroseVenzymesucrose + H2Oglucose + fr

31、uctose1、中间产物假说：、中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。产物和游离的酶。 231KEPKESKSE一级反应：反应开始反应速度一级反应：反应开始反应速度V与底物浓度与底物浓度S成正比关成正比关系。系。混合级反应：随混合级反应：随S增高，反应速度并不按正比升高。增高，反应速度并不按正比升高。零级反应：随零级反应：随S增高，增高，V不再上升，趋向一个极限，趋不再上升，趋向一个极限，趋向向Vmax.说明酶可被底物饱和的现象，所有的酶都有此现象。说明酶可被底物饱和的现象，所有的酶都有此现象。

32、中间产物假说：中间产物假说：中间产物假说证据：中间产物假说证据：（1）竞争性抑制实验）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性）底物保护酶不变性（3）结晶）结晶ES复合物的获得。复合物的获得。快速平衡假说：酶与底物两者反应速度较快，迅速建立快速平衡假说：酶与底物两者反应速度较快，迅速建立平衡。平衡。米氏学说：米氏学说：2、米氏学说：、米氏学说：1913年年Michaelis和和Menten提出，建提出，建立在以上两个学说基础上建立的立在以上两个学说基础上建立的V与与S的定量关系，建的定量关系，建立了米氏方程立了米氏方程。*maxSKsSVVKs为底物解离常数（底物常数）)(12ESSESEkkKs

33、 231KEPKESKSE（二（二）米式方程的导出：米式方程的导出：1、早年的米式方程基于快速平衡假说早年的米式方程基于快速平衡假说 4231KKEPKESKSE在反应的初始阶段，在反应的初始阶段，S远远大于远远大于E，因此，因此，S可以认为不可以认为不变。变。因为研究的是初速度，因为研究的是初速度，P的量很小，由的量很小，由P+EES可以忽略不记。可以忽略不记。 231KEPKESKSE游离的酶与底物形成游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而的速度极快（快速平衡），而ES形形成产物的速度极慢，故，成产物的速度极慢，故，ES的动态平衡与的动态平衡与ESP+E没有关没有关系系（即（即K

34、1、K2K3）ES的生成速度：K1（E - ES）SES的分解速度：K2ESK1（E - ES）S = K2ES121SKKSEKES反应速度： max1233SKSVSKKSEKESKVSKS现在称为底物常数 231KEPKESKSE2、“稳态平衡假说稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：及其对米式方程的发展：Briggs和和Haldane1925ES的动态平衡不仅与的动态平衡不仅与E+SES有关，还与有关，还与ESP+E有关。有关。稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第点。点。所谓所谓“稳态稳态”：ES的形成速度与分解速度相等、的形成速度与分

35、解速度相等、ES的浓度保持不变的反应状态的浓度保持不变的反应状态 231KEPKESKSEES生成速度：k1（E - ES）SES分解速度：k2ES+k3ES以上两个速度相等：k1（E - ES）S = k2ES+k3ES132SKmSESKKKSEES用稳态假说推导米式方程：用稳态假说推导米式方程： 231KEPKESKSEmax33SKSVSKmSEKESKVm132KKKKmVmax=k3 E （米氏常数）（米氏常数）当当Km及及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。物浓度的关系。（单体酶）（单体酶）nmnSKSVVmax（

36、寡聚酶）（寡聚酶）当SKm时maxmaxSKKSVSKSVVmm当SKm时，即酶被底物饱和时。当S=Km时2maxmaxVSKSVVmmaxmaxmaxVSSVSKSVVm（三）（三）米式方程中各参数的意义米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当当K1、K2K3时，即时，即ESP+E是整个反应平衡中极慢的一步：是整个反应平衡中极慢的一步： SKKKKKKKm12132maxmaxSKSVSKSVVSm“稳态平衡稳态平衡=快速平衡快速平衡+慢速平衡慢速平衡”：1312132KKKKKKK当当ESP+E极慢极慢（K3/K1极小）时，稳态平

37、衡基本等于快速平衡极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡 231KEPKESKSE都是都是K3惹的祸惹的祸2、Km的物理意义的物理意义当反应速度当反应速度v=1/2Vmax时，时，Km=S，Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。时底物的浓度。单位：单位：molL-1或或mmolL-1，与底物浓度单位相同。与底物浓度单位相同。Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件（如类及反应条件（如pH值和温度值和温度)有关，与酶的浓度无有关，与酶的浓度无关。关。P112表表4-4一

38、些酶的一些酶的Km值。值。3、Km与天然底物与天然底物Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示一半所需的底物浓度愈小）表示V对对S越灵敏。越灵敏。VS1/2VmaxKm4、Km、Ks与底物亲和力与底物亲和力Km是是ES分解速度（分解速度（K2+K3）与形成速度（与形成速度（K1）的比值，它包含的比值，它包含ES解离趋势（解离趋势（K2K1）和产物形成趋势（和产物形成趋势（K3K1）。）。Ks是底物常数，只反映是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），解离趋势（底物亲和力），1/K

39、s可以可以准确表示酶与底物的亲和力大小。准确表示酶与底物的亲和力大小。1/Ks越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。只有当只有当K1、K2K3时，时，KmKs，因此，因此，1/Km只能近似地表示只能近似地表示底物亲和力的大小。底物亲和力的大小。1/Km越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。越大酶与底物的亲和力越大，反之越小。底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势有关。即与趋势有关。即与K3K1有关。有关。131312132KKKKKKKKKKKsm问题：问题：（1）Km越小，底物亲和力越大

40、（越小，底物亲和力越大（X）（2）Ks越小，底物亲和力越大（越小，底物亲和力越大（）（3）天然底物就是亲和力最大的底物（天然底物就是亲和力最大的底物（X）（4）天然底物就是天然底物就是Km值最小的底物（值最小的底物（）（5）底物亲和力越大酶促反应速度越大（）底物亲和力越大酶促反应速度越大（X）（6）对于不同的酶或同一种酶的不同底物，对于不同的酶或同一种酶的不同底物，Km越小反应速度越大（越小反应速度越大（X）5、Km与米式方程的实际用途与米式方程的实际用途（1）根据）根据S求求V（2）根据根据V（或相对速度或相对速度a）求求Smax33SKSVSKmSEKESKVmnmnSKSVVmax设定达

41、到最大反应速度的设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为倍时，所需底物浓度为S0.9S0.9=9Km同理有：同理有：S0.8=4KmS0.7=2.33KmS0.6=1.5KmS0.5=1KmS0.1=1/9KmS0.9/S0.1=81S0.7/S0.1=21说明：米氏方程只适合一定条件下单底物，只形成一个酶底物复说明：米氏方程只适合一定条件下单底物，只形成一个酶底物复合物并只产生一个产物的酶促反应。但对于形成多个中间物，合物并只产生一个产物的酶促反应。但对于形成多个中间物，不只一个底物和不只一个产物的酶以及多酶复合体则不能解不只一个底物和不只一个产物的酶以及多酶复合体则不能解释。释。m

42、axSKSVVaYm当当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与与S无关，无关，只和只和E成正比。成正比。当当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。时，表示活性部位有一半被占据。KmYYS1（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：（4）根据）根据Km推测代谢的方向及程度推测代谢的方向及程度根据正逆反应根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。度推测酶促反应的正逆方向。根据代谢途径中各个酶的根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断及其

43、相应底物浓度判断限速步骤（限速步骤（Km最大的步骤不一定是限速步骤）最大的步骤不一定是限速步骤）根据根据Km值的大小判断分支代谢的流向值的大小判断分支代谢的流向酶工程与代谢工程中改造酶的酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强调控代谢途径（强化则降低化则降低Km，弱化则提升弱化则提升Km）6、Vmax与与K3（Kcat）的意义的意义在一定的酶浓度下，在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。类及反应条件有关。Vmax=K3EK3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数

44、（或催化常数，子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），），表明酶的表明酶的最大催化效率最大催化效率P113表表4-5一些酶的最大转换数一些酶的最大转换数转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。个底物分子所需的时间。乳糖脱氢酶转换数为乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为秒，则它的催化周期为10-3秒秒7、Kcat/Kmrepresentsactualcatalyticefficiencybecausein vivo S/Km=0.01-1.0 maxSKmSEKcatSKmSVvSKm 时： SEKmKcatv

45、13213kkkkkKKmcatKcat/Km的上限是的上限是K1，既生成既生成ES复合物的速度复合物的速度(酶促反酶促反应的速度不会超过应的速度不会超过ES的形成速度的形成速度K1，在水相中不会超过在水相中不会超过108109）只有只有Kcat/Km可以客观地比较不同酶或同一种酶催可以客观地比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率化不同底物的催化效率（四）（四）Km和和Vmax的求解方法的求解方法1、Lineweaver-Burk双倒数作图法双倒数作图法maxmax111VSVKVmmaxSKSVVm1/Vmax1/Km1/S1/V斜率=Km/Vmax选底物浓度应考虑能否得到1/S的常数增

46、量：S为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时1/S为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。S为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，1/S为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。 2、Eadie-HofsteeVV/S作图法作图法见见p115。3、Hanes-Woolf作图法作图法见见p115。（4）Eisenthal作图法作图法见王镜岩见王镜岩p363。（5）Hill 作图法mLogKSLognVVVLogmaxmLogK

47、SLognYYLog1-LogKmLogS）（VVVLogYYLogmax1（寡聚酶）三、三、多底物的酶促反应动力学多底物的酶促反应动力学（一）多底物酶促反应有（一）多底物酶促反应有二种动力学机理二种动力学机理1.sequentialreactions（single-displacementreactions):序序列反应或单置换反应列反应或单置换反应1）Orderedreaction(orderedBiBi)，即有序反应即有序反应2）Randomreactions(randomBiBi)，即随机反应即随机反应2.Pingpongreactions（double-displacementrea

48、ctions)，即乒乓反应或双置换反应即乒乓反应或双置换反应1、有序反应机理（有序反应机理（orderedreactions,orderedBiBi)只有只有Leadingsubstrate(领先底物领先底物A)首先与酶结合，然后首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternarycomplex)转变为转变为EPQ，B的产物的产物P先释放，先释放，A的产物的产物Q后后释放。释放。在缺少在缺少A时，时，B不能与不能与E结合结合EAEAEBQEPQEEABPQA与其产物与其产物Q相互竞争地结合相互竞争地结合EPEAAEAEBQEPBQEQ反应的总方

49、向决定于反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数的浓度和反应的平衡常数NAD与与NADH相互竞争相互竞争E上的上的NAD结合部位结合部位2、随机反应机理（随机反应机理（randomreactions)(randomBiBi)底物底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物复合物AEBQEP，产物产物P、Q的释放顺序也的释放顺序也是随机的。是随机的。 示意图示意图p119图图411（b)限速步骤是限速步骤是AEBQEPA与与Q相互竞争相互竞争E上的底物结合部位上的底物结合部位A，B与与P相互竞争相互竞争E上的底物结合部位上的底物结合部位B反应的总方向

50、决定于反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反的浓度和反应的平衡常数应的平衡常数糖原磷酸化酶：糖原与小糖原竞争糖原磷酸化酶：糖原与小糖原竞争E上糖原结上糖原结合部位，合部位，Pi与与G-1-Pi竞争竞争E上上Pi结合部位结合部位3、乒乓反应机理乒乓反应机理Pingpongreactions（double-displacementreactions)底物底物A先与先与E结合成结合成AE二元复合物，二元复合物，AEPE（修饰修饰酶形式），释放第一个产物酶形式），释放第一个产物P，接着底物接着底物B与与E形成形成EB，EBEQ，释放第二个产物释放第二个产物Q示意图示意图p119图图411(c)A与

51、与Q竞争自由酶形式竞争自由酶形式E，B与与P竞争修饰酶形竞争修饰酶形式式E整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式元复合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶符合双置换、双底物机制的酶符合双置换、双底物机制的酶谷氨酸谷氨酸(A)与天冬氨酸与天冬氨酸(Q)竞争性结合竞争性结合E-磷酸吡磷酸吡哆醛，哆醛，a-酮戊二酸酮戊二酸(P)与草酰乙酸与草酰乙酸(B)竞争性结合竞争性结合E-磷酸吡哆胺磷酸吡哆胺（二）双底物反应的动力学方程（二）双底物反应的动力学方程1、乒乓机制的动力学方程、乒乓机制的动力学方程 maxBAAKBKBAVV

52、BmAmmaxmaxmax1111VBVKAVKVBmAmKmA：B达到饱和浓度时达到饱和浓度时A的米氏常数的米氏常数KmA：A的表观米氏常数的表观米氏常数Vmax：AB都达到饱和浓度时的最大反应速度都达到饱和浓度时的最大反应速度乒乓机制的动力学曲线乒乓机制的动力学曲线(见见p121图图414）乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线表观米氏常数KmA（KmB）随B（ A）浓度的增大而增大表观最大反应速度Vmax 随B（A）的增大而增大2、序列机制的底物动力学方程、序列机制的底物动力学方程BmAsmaxKKBAAKBKBAVVBmAm 11111maxmaxmaxmaxBAVKKVBVKAVKVBm

53、ABmAms序列机制的动力学曲线序列机制的动力学曲线(见见p121图图412和图和图413）序列机制的动力学曲线是两组相交直线（交于序列机制的动力学曲线是两组相交直线（交于X轴负侧）轴负侧）交点在交点在X轴：表观轴：表观KmA（KmB）不随不随B（A）浓度变化而变化（浓度变化而变化（KmA=KmA、KmB=KmB）交点在交点在X轴上：表观轴上：表观KmA（KmB）随随B（A）浓度的增加而减小浓度的增加而减小交点在交点在X轴下：表观轴下：表观KmA（KmB）随随B（A）浓度的增加而增大浓度的增加而增大表观最大反应速度表观最大反应速度Vmax随随B（A）的增大而的增大而增大增大四、四、pH对酶促反

54、应速度的影响对酶促反应速度的影响1.pH影响酶活力的因素影响酶活力的因素影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响离状态，最终影响ES形成。形成。影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。2酶的最适酶的最适pH和稳定性和稳定性pH最适最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质使酶促反应速度达到最大时的介质pH。最适最适pH与底物

55、种类、浓度及缓冲液成分有关。与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。几种酶的最适几种酶的最适pH，见见P117。虽然大部分酶的虽然大部分酶的pH酶活力曲线是钟形，但也有半钟酶活力曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。形甚至直线形。五、五、温度对酶促反应速度的影响。温度对酶促反应速度的影响。1最适温度及影响因素最适温度及影响因素温度对酶促反应速度的影响有两个方面：温度对酶促反应速度的影响有两个方面：提高温度，加快反应速度。提高温度，加快反应速度。提高温度，酶变性失活。提高温度，酶变性失活。最适温度：在一定温度下，酶反应速度即酶活力最高，最适温度：在一定温度下，酶反应速度即酶活力最高，此温度叫酶的最适温度

56、。此温度叫酶的最适温度。温度温度酶活力曲线一般也是酶活力曲线一般也是钟形钟形温度系数温度系数Q10：温度升高温度升高10，反应速度与原来的反应，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的速度之比，大多数酶的Q10一般为一般为12。温血动物的酶，最适温度温血动物的酶，最适温度3540，植物酶最适温度，植物酶最适温度4050，细菌，细菌TaqDNA聚合酶聚合酶70。最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度离子强度等因素有关。等因素有关。2、酶的稳定性温度、酶的稳定性温度在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的在某一时间

57、范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。稳定性温度。酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。温度增高。六、六、激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。无机离子或简单有机化合物对酶的激活。无机离子或简单有机化合物对酶的激活。无机离子或蛋白酶对酶原的激活。无机离子或蛋白酶对酶原的激活。1、无机离子的激活作用无机离子的激活作用（1）金属离子：）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）阴离子：阴离子：cl-、Br

58、-、PO43-（3）氢离子氢离子 不同的离子激活不同的酶。不同的离子激活不同的酶。不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与与K+、Mg+与与Ca+之间常常拮抗，但之间常常拮抗，但Mg+与与Zn+常可替代。常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM2、简单有机分子的激活作用简单有机分子的激活作用还原剂（如还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有性中心含有SH的酶。的酶。金属螯合剂（金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解能去除酶中重金属离子，解除

59、抑制作用。除抑制作用。3、蛋白酶对酶原的激活、蛋白酶对酶原的激活七、七、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用变性作用(denaturation)：失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。作用。抑制作用抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性变性剂没有选择性抑制剂：能对酶起抑制作用的物质。有不同程度抑制剂：能对酶起抑制作用的物质。有不同程度的选择性的选择性研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理

60、和抑制剂型药物的设计与开）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发发（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控代）了解生物体的代谢途径，进行人为调控代谢或代谢控制发酵谢或代谢控制发酵（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础（一）抑制程度的两种表示方法（一）抑制程度的两种表示方法相对活力分数（残余活力分数相对活力分数（残余活力分数相对活力百分数相对活力百分数（残余活力百分数）（残余活力百分数）2、抑制率、抑制率抑制