液相增加柱效提高灵敏的小诀窍学习教案

1、会计学1液相增加液相增加(zngji)柱效提高灵敏的小诀柱效提高灵敏的小诀窍窍第一页，共15页。环保环保(hunbo)样品样品: 除草剂除草剂流动相流动相: 52/48 0.1 M乙酸钠乙酸钠/甲甲醇醇, pH 6流速流速: 0.45 mL/min温度温度(wnd): 40, 90检测检测: UV除草剂除草剂: 柱温的影响柱温的影响(yngxing)Herbicides: Effect of Column Temperature1. 西玛津西玛津2. 敌草隆敌草隆3. 扑灭津扑灭津4. 扑灭净扑灭净5. 异丙甲草胺异丙甲草胺1. Simazine2. Diuron3. Propazine4.

2、Prometryn5. etolachlor液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m4090提高柱温，可增加柱效提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第1页/共15页第二页，共15页。生物制药生物制药液相色谱液相色谱(s p)柱柱: Zorbax 300 StableBond-C3色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 肽类肽类/蛋白质蛋白质: 升温对分离升温对分离(fnl)的影响的影响Peptides/Proteins: Effect of Elevated Tempera

3、ture样品样品: 多肽多肽 流动相流动相: A = 5: 95, 乙腈乙腈 : 水水, 0.10%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)B = 95: 5, 乙腈乙腈 : 水水, 0.085%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)梯度梯度: 在在 20 min内内 15-53%, 后运行时间后运行时间(shjin) 12 min流速流速: l.0 mL/min 温度温度: 室温室温 -60检测检测: UV 215 nm1. 亮氨酸脑啡呔亮氨酸脑啡呔 2. 血管紧张素血管紧张素II 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶A 4. 牛胰岛素牛胰岛素 5. 细胞色素细胞色素C 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 肌红蛋白肌红蛋白 8.

4、 碳酸酐酶碳酸酐酶1.Leucine Enkephalin2. Angiotensin II3. Rnase A4. Insulin(BOV)5. Cytochrome C6. Lysozyme7. Myoglobin8. Carbonic anhydrase提高柱温，提高柱温，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第2页/共15页第三页，共15页。生物制药生物制药液相色谱液相色谱(s p)柱柱: Zorbax StableBond-C8色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 150 mm, 5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高(t go)低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏

5、度Reducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samples流动相流动相: 60%乙腈乙腈/40%水水流速流速: 内径内径 0.3 mm-4 uL/min内径内径 0.5 mm-10 uL/min内径内径 1.0 mm-50 uL/min内径内径 4.6 mm-1.0 uL/min温度温度(wnd): 室温室温检测器检测器: UV 254 nm样品样品: 200 ng联二苯联二苯 (100 nl) 减小柱径，可增减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）第3页/共15页第四页，共15页。

6、色谱柱技术色谱柱技术(jsh) 5988-6454EN使用小体积色谱柱对于检测器响应使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性时间的重要性 (TE32)液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-C18色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 15 mm 3.5m流动相流动相: 乙腈乙腈: 1%甲酸甲酸(ji sun)=32: 68UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min. 30C进样量进样量: 5 L响应时间响应时间: 4.0秒秒响应时间响应时间: 2.0秒秒响应时间响应时间: 1.0秒秒响应时间响应时间: 0.5秒秒响应时间响应时间: 0.1秒

7、秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide缩短检测器响应时间缩短检测器响应时间，可增加柱效，可增加柱效 （提（提高灵敏度）高灵敏度）第4页/共15页第五页，共15页。色谱柱技术色谱柱技术 ：不同硅胶类型：不同硅胶类型(lixng)比较比较 (TE1)流动流动(lidng)相相: 含含0.05%甲醇的二氯甲烷甲醇的二氯甲烷 液相色谱液相色谱(s p)柱柱1.toluene2.benzanilide3.phenol4.benzyl alcoholZorbax SilSpherisorbZo

8、rbax Rx-Sil1.甲苯甲苯2.N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.苯酚苯酚4.苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第5页/共15页第六页，共15页。有机化学有机化学 5988-6366ENpH对苯胺取代物分析对苯胺取代物分析(fnx)的影响的影响 (ORCH1)流动相流动相25mM磷酸磷酸: 甲醇甲醇(ji chn)=58: 42 流速流速: 1 mL/min 22C液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-C18色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺2.间

9、位苯甲胺间位苯甲胺3.3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈4.对位氯苯胺对位氯苯胺5.间位氯苯胺间位氯苯胺6.邻位氯苯胺邻位氯苯胺pH: 2.5pH: 7.0改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第6页/共15页第七页，共15页。生化生化 肽肽 5988-6293EN三氟乙酸浓度对于三氟乙酸浓度对于(duy)反相肽的分离的影响反相肽的分离的影响 (B10)Peptide流动相流动相: A: 水和三氟乙酸水和三氟乙酸B: 乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0 - 30% B （30 min.内）内）流速流速: 1 mL/minUV: 254 nm进样量进样量: 6uL十肽菌素

10、标样十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微（疏水性有略微(lwi)差差异）异）40C液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX 300 SB-C8色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第7页/共15页第八页，共15页。食品分析食品分析 5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离流动相强度对单糖和二糖分离(fnl)的影响的影响 (FD4)流动流动(lidng)相相: 乙腈乙腈/水如图水如图流速流速: 1 mL/mi

11、n示差折光检测器示差折光检测器液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX NH2 色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m1.果糖果糖2.葡糖葡糖3.蔗糖蔗糖4.Palatinose5.海藻糖海藻糖6.异麦芽糖异麦芽糖乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25 改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第8页/共15页第九页，共15页。色谱柱技术色谱柱技术 5988-6468EN有机有机(yuj)改性剂和改性剂和pH对于选择性的影对于选择性的影响响 (TE5)流动流动(lidng)相相: 25 mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速:

12、1.0 mL/min.22C液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-CN色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.anisidine2.m-toluidine3.4-cl-aniline4.3-aminobenzonitrile5.3-cl-aniline6.2-cl-aniline1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.4-氯氯-苯胺苯胺4.3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.3-氯氯-苯胺苯胺6.2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇 ：58%缓冲液缓冲液 30%甲醇甲醇 ：70%缓冲液缓冲液pH 2.6pH 3.0改变有机相改变有机相

13、%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第9页/共15页第十页，共15页。色谱柱技术色谱柱技术(jsh) 5988-6453ENZORBAX Eclipse系列色谱柱的选系列色谱柱的选择性择性 (TE31)液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m流动流动(lidng)相相: 甲醇甲醇 : 水水=70: 30UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.室温室温Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Ec

14、lipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改变键合相，改变键合相，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第10页/共15页第十一页，共15页。生物制药生物制药液相色谱液相色谱(s p)柱柱: Zorbax Extend-C18色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLCESI-MS分离分离(fnl)的选择性比较的选择性比较Se

15、lectivity Comparison of TFA and NH4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速: 0.25 mL/min. 温度温度(wnd): 25 梯度梯度: 5-60% B in 20 min.LC/MS: 正离子正离子, ESI- Vf 70V, Vcap 4.5 kV, N2- 35 psi, 12 L/min., 300样品样品: 4L (各各50 ng)三氟乙酸条件三氟乙酸条件: A- 0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80%的乙腈溶液的乙腈溶液NH4OH条件条件: A- 20 mM N

16、H4OH水溶液水溶液B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈溶的乙腈溶液液改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）第11页/共15页第十二页，共15页。生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN酸对于酸对于(duy)反相肽的分离的影响反相肽的分离的影响(B16)decapeptide液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX 300 SB-C8 色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.十肽菌素十肽菌素 S12.十肽菌素十肽菌素 S23.十肽菌素十肽菌素 S34.十肽菌素十肽菌素 S45.十肽菌素十肽菌素 S

17、51.decapeptide S1 2.decapeptide S2 3.decapeptide S3 4.decapeptide S4 5.decapeptide S50.1% 三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H3PO4改变有机改变有机(yuj)添加添加剂剂可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）流动相流动相: A: 含相应的酸的水相含相应的酸的水相 B: 含相应的酸的乙腈含相应的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.内）内）进样量进样量: 6L肽标样肽标样UV: 254 nm流速流速: 1 mL/min40C第12页/共15页第十三页，共15页。色谱柱技术色谱柱技术(jsh)

18、流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱液相色谱(s p)柱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱色谱(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5mUV: 254 nm流速流速(li s): 1 mL/ min.室温室温1.Uracil2.Butylparaben3.Naphthalene4.Dipropylphthalate5.Acenaphthene1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix A: 水水 B: 甲醇甲醇, 用泵抽取用泵抽取50% B体积比混合体积比混合: Vol