常用分析化学技术 色谱法

1、色谱分析法 1906年，俄国植物学家 茨维特发表了他的实验结果：为了别离植物色素，他将含有植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗。俄国植物学家茨维特一、概论别离过程 茨维特植物色素别离实验图示：样 品：植物色素固定相：CaCO3颗粒流动相：石油醚 流动相石油醚混合色素叶绿素叶黄素胡萝卜素分离组分色谱柱固定相碳酸钙 由于不同的色素在碳酸钙颗粒外表的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了别离。 茨维特将这种别离方法命名为色谱法。色谱法 色谱法又称色层法或层析法，是一种根据物质的物理或物理化学性质不

2、同而进行的别离分析方法。 色谱分析包括两个过程： 1.别离过程； 2.分析过程。 更注重别离过程。 色谱法主要关注别离相关理论及方法。 实现色谱操作的根本条件是必须具备相对运动的两相，固定相和流动相。 固定相：在色谱别离中固定不动，对组分产生保存作用的一相。 流动相：携带试样混合物流过固定相的气体或液体。 担体：又称载体，是一种多孔性化学惰性固体，在色谱中用于承载液体固定相。1.色谱别离过程 保存作用：组分与固定相作用而被固定称之。 迁移作用：组分溶解在流动相中，随流动相移动称之。 差速迁移：不同组分的结构和性质有差异，导致各组分与固定相作用能力不同，在流动相中的溶解度不同，移动速度产生差异的

3、现象。 组分在色谱别离过程中有两种行为： a.保存作用：与固定相作用，被固定相作用。 b.迁移作用: 溶解在流动相中，随流动相移动。 不同的组分，由于组成、结构和性质的不同，与固定相作用能力不同，在流动相中的溶解度不同，移动速度不同： 与固定相作用能力强，在流动相中的溶解度小的组分，移动速度慢： 反之，与固定相作用能力弱，在流动相中的溶解度大的组分，移动速度快。 将小差异累积数千乃至数百万次，产生大差异，从而将各组分别离。 组分的结构和性质微小差异 与固定相作用有微小差异 随流动相移动的速度不同 差速迁移 将小差异重复屡次 产生大差异 色谱别离。例：纸色谱, 以正丁醇:甲酸:水混合溶液作流动相

4、，用0.1%茚三酮溶液显色，混合物中有赖氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸。 移动最快：亮氨酸。 移动最慢：赖氨酸。例：纸色谱, 以1mol/lHAc作流动相，混合物中有水杨酸、苯酚、邻苯二酚。 移动最快：水杨酸。 移动最慢：苯酚。 流动相HAc为强极性溶剂。 在水杨酸、苯酚、邻苯二酚三种化合物中，水杨酸极性最强，邻苯二酚次之，苯酚最弱。 根据“相似相溶原那么，水杨酸在HAc中溶解度最大，移动最快。苯酚在HAc中溶解度最小，移动最慢。例：薄层色谱, 以硅胶作吸附剂，用乙醇作流动相，混合物中有苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯。 移动最快：苯甲酸苯甲酯。 移动最慢：苯甲酸。 在苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯三种化

5、合物中，苯甲酸极性最强，苯甲醇次之，苯甲酸苯甲酯最弱。 分子极性越强，与吸附剂的作用力越大，越易被吸附，移动速度越慢； 反之，分子极性越弱，与吸附剂的作用力越小，移动速度越快。 苯甲酸苯甲酯极性弱，与硅胶的吸附力小，移动速度快； 苯甲酸极性强，与硅胶的吸附力大，移动速度慢。2. 色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。表 色谱法以流动相种类的分类色谱类型流动相主要分析对象气相色谱法气体挥发性有机化合物液相色谱法液体溶于水或有机溶剂的各种物质超临界色谱法超临界流体各种有机化合物电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物1按两相分子的聚集状态分类2 按固定相的固定方式分类平面色谱 纸色谱

6、薄层色谱高分子薄膜色谱柱 色 谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 分配色谱： 利用分配系数的不同吸附色谱： 利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3按别离机制分类流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱液相色谱 气相色谱 3.色谱法的特点(1)别离效率高 复杂混合物，同系物、异构体、手性异构体。(2) 灵敏度高 可以检测出-1(10-6)级甚至-1(10-9)级的物质量。(3) 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 色谱别离是所有的别离方式中，别离效率最高的。

7、常见的别离方式：沉淀过滤、重结晶、分液、萃取、蒸馏、升华、离心、电泳等二、色谱别离原理 沉淀过滤用于别离溶液和固体不溶物。 重结晶用于溶液中一种物质溶解度随温度变化较大而另一种物质溶解度随温度变化较小的情况。 例如：硝酸钾溶解度随温度变化大，氯化钠溶解度随温度变化小，可用重结晶从混合液中提纯硝酸钾。 分液用于别离两种不同密度且不相混溶的液体。 例如：水和植物油的别离。 萃取用于溶质在两种互不相溶的溶剂里溶解度不同。 蒸馏用于别离各组分沸点不同的液态混合物。 升华适用于有升华特性的物质。 离心别离用于不溶性微粒与液体，或两种密度不同且不相混溶的液体混合物，借助离心力不同的而到达别离。 电泳别离是

8、利用带电粒子在电场中移动速度不同而到达别离。 不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同而移动速度不同，在电场中电泳一段时间后，由于移动距离不同而相互别离。 色谱主要是一种别离方式。 色谱别离是利用不同组分与固定相和流动相之间作用的差异： 吸附色谱，利用吸附剂外表的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现别离。 分配色谱，利用被别离组分在固定相和流动相中的溶解度差异而实现别离。 离子交换色谱，利用被别离离子与固定相之间亲合力差异实现别离。 空间排阻色谱，利用被别离组分分子尺寸大小不同而渗透能力差异进行别离。 吸附色谱的固定相为固体吸附剂，因外表存在许多吸附中心而具有吸附作用。

9、被别离组分与固定相的外表吸附，是别离组分分子与吸附剂外表分子的分子间里的相互作用所引起的 。 分子间里的相互作用与分子结构、极性等因素有关。 1.吸附色谱 母核相同化合物，官能团极性越大，整个分子极性越大，越易被吸附 。 常见官能团极性顺序：羧基 酚羟基羟基氨基醛基酮基酯基 醚基 双键相应的有机物类别羧酸 酚 醇 胺 醛 酮 酯 醚 烯 烷烃 强极性基团如羧基、羟基、氨基越多，极性越大。 烷烃类非极性化合物，不易被吸附； 形成分子内氢键时，吸附力减弱； 分子内烷基含碳数越多，极性越弱，吸附力减弱； 同系物中，分子量越大，极性越小，吸附力越弱。 分子极性大，易被吸附 ，后流出色谱柱； 反之, 分

10、子极性小，吸附力弱，先流出色谱柱。相似相溶原那么 “相似相溶原那么，即非极性物质易溶解在非极性溶剂中(例如碘溶于四氯化碳中)，极性物质和离子型晶体易溶于极性溶剂(如水)中。主要表现在： a. 溶质分子和溶剂分子的结构越相似，相互溶解越容易； 2.分配色谱 b. 溶质分子与溶剂极性越相似，越易互溶。 c. 溶质分子与溶剂分子的分子间力越相似，越易互溶。 根据流动相和固定相相对极性不同，液-液色谱有正相和反相之分。固定相的极性比流动相强的, 称正相色谱。反之，流动相极性大于固定相极性的，称为反相色谱。正相色谱中流动相的极性比固定相小，根据相似相溶原那么，极性小组分在流动相溶解度较大，移动速度较快。

11、反相色谱中流动相的极性比固定相大，根据相似相溶原那么，极性大组分在流动相溶解度较大，移动速度较快。 正相色谱的流出顺序是：极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反：极性大的先流出，极性小的后流出。 3.离子交换色谱 固定相为离子交换树脂。 离子交换树脂具有固定离子基团及可交换离子基团。 离子交换树脂上分子骨架上连接着活性基团，如SO3，N(CH3)3+等。 为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子，此即为可交换的离子基团。阳离子交换剂:对阳离子具有交换能力。 按活性基团分类，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阴离子交换剂:对阴

12、离子具有交换能力。阴离子交换4.空间排阻色谱 又称凝胶色谱、尺寸排阻色谱。 固定相为凝胶。凝胶是有机物制成的分子筛，其中常用的是葡聚糖凝胶，它是多孔性网状结构物质。 凝胶具有多孔性网状结构，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。 各组分在固定相、流动相之间不是靠其相互作用力的不同来进行别离，而是按分子大小进行别离。 各组分在凝胶中的滞留时间取决于分子大小,分子小的化合物可以进入孔中，滞留时间长；分子大的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。 依次按大分子、中等分子、小分子顺序流出，从而到达别离目的。空间排阻别离原理图三、色谱技术 柱色谱又称柱层析。将色谱填

13、料装填在色谱柱管内作固定相的色谱方法。 操作过程：装柱 加样 洗脱。 将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，用流动相洗脱。1.柱色谱 常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。 收集别离后的纯洁组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以适宜的溶剂浸泡固定相提取组分分子。 2. 薄层色谱又叫薄板层析。通常将固定相均匀地涂铺在外表洁净的玻璃、塑料或金属板形成薄层，制成薄板，进行样品别离。操作过程：薄层板的制备点样展开显色 a.薄层板的制

14、备 薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。 薄层应尽量均匀且厚度要固定。 b. 点样 先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。 假设因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发前方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响别离效果。点样要轻，不可刺破薄层。 c.展开 薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。 在层析缸中参加配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。 将点好的薄层板小心放入层析缸中。点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出， 在板上标上展开剂前沿位置。晾干

15、，观察斑点位置。 d.显色 当组分无色时，需喷洒显色剂使斑点显色。 对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈有色斑点。薄层色谱3. 纸色谱 又叫纸层析。以滤纸为载体的色谱法，别离原理属分配色谱法。 固定相：纸纤维上吸附的水 流动相：与水不相混溶的溶剂。 纸色谱以滤纸作载体。滤纸是由纤维素组成，纤维素上有多个OH，能吸附水。 这些吸附水就构成了色谱过程的固定相，展开剂(与水不相混溶的有机溶剂)为流动相，滤纸只起到支持固定相的作用。 当样品点在滤纸一端，放在一密闭器中，让流动相通过毛细管作用从滤纸一端，经过点样点流向另一端，样品中溶质在固定相水、流动相有机溶剂中进

16、行分配。 易溶于有机溶剂而难溶于水的组份，随流动相往前移动速度快些，而易溶于水，难溶于有机溶剂的组份，随流动相向前移动速度慢些，从而到达将不同组份别离的目的。 纸色谱的操作，除不需要制备薄层板外，其他点样、展开、显色与薄层色谱相似。 纸层析4.气相色谱 气相色谱是机械化程度很高的色谱方法，气相色谱系统由气源、色谱柱和柱箱、检测器和记录器等局部组成。 气源负责提供色谱分析所需要的载气，即流动相，载气需要经过纯化和恒压的处理。 气相色谱的色谱柱一般直径很细长度很长，柱内或者填充填料或者涂布液相的固定相。 检测器是气相色谱带给色谱分析法的新装置，在经典的柱色谱和薄层色谱中，对样品的别离和检测是分别进

17、行的，而气相色谱那么实现了别离与检测的结合。 气相色谱检测器种类很多。最常用的有热导检测器、氢火焰离子化检测器、火焰光度检测器等。 热导检测器是基于不同组分与载气有不同的热导率的原理而工作的热传导检测器。敏感元件为热丝，如钨丝，并由热丝组成电桥。 当被测组分与载气一起进入热导池时，由于混合气的热导率与纯载气不同，致使钨丝温度发生改变，其电阻也随之改变，进而使电桥输出端产生不平衡电位而作为信号输出。 氢火焰离子化检测器适合痕量有机物的分析。 氢焰检测器由离子室、离子头及气体供给三局部组成。微量有机物被载气带入检测器，在氢火焰的作用下离子化。 产生的离子在发射极和收集极的外电场作用下定向移动而形成

18、微弱的电流。微电流经放大，由记录仪记录下来。 火焰光度检测器是气相色谱仪用的一种对含磷、含硫化合物有高选择型、高灵敏度的检测器。 试样在富氢火焰燃烧时，含磷有机化合物主要是以HPO碎片的形式发射出波长为526nm的光，含硫化合物那么以S2分子的形式发射出波长为394nm的特征光。 光电倍增管将光信号转换成电信号，微电流经放大，由记录仪记录下来。5.高效液相色谱 高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱。 由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压，高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。 气相色谱仅能分析在操作温度

19、下能汽化而不分解的物质。据估计，在化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15%。 对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物、离子型化合物等，难以用气相色谱法进行分析。为解决这个问题，开展了高效液相色谱。 高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同，但是它采用高压泵和高灵敏度检测器。 高效液相色谱的检测器很多，最常用的有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。 紫外检测器的工作原理如下：由光源产生的紫外光或可见光， 经过透镜变成两束平行光，无样品通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。 示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的。 光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过工作池时，由于存在待测组分而使折射率改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。 荧光检测器适合于稠环芳烃、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。 荧光物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较 长的光，这种光称为荧光。 在其他条件一定的情况下，荧光强度与物质的浓度成正比。在紫外光激发下，荧光物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。四、色谱应用