第六章(3)2009-10-()

1、6.3.2. 液相色谱柱的装填液相色谱柱的装填6.3.3.柱效考察柱效考察 分配比 k( tR tm)/ tm 理论板数 n 16( tR / tw )2 理论板高 H L /n 折合板高 h L / dP 折合流速 v(L dP) /(Dmtm) 柱阻参数 (P tm dP2) /( L2 ) 对称因子 SI注明注明：样品样品、固定相固定相、流动相流动相、温度温度、流量流量、梯度梯度、检测器等操作条件检测器等操作条件 6.3.4. 组合柱组合柱, 柱的保护柱的保护 1. 组合柱组合柱 组合柱就是将不同固定相的色谱柱串联起来。组合柱就是将不同固定相的色谱柱串联起来。 2.色谱柱的保护和保护柱色

2、谱柱的保护和保护柱 6.19 保护柱对柱效的影响流量 2.0ml/min,=0.3cm/s流量 4.0ml/min,=0.6cm/sk无保护柱有保护柱无保护柱有保护柱00.30.51.22.75.475994310114108180771076206871413011000737079007290557034407440467053305300343040107650467052905050 6.3.5. 色谱柱的选择色谱柱的选择 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择:以样品的性质为依据以样品的性质为依据, , 包括包括: : 分子量、在水中的溶解度、分子量、在水中的溶解度、极性、离子或非离子

3、以及稳定性等极性、离子或非离子以及稳定性等. 对于未知样品对于未知样品, , 要尽量获得以下信息要尽量获得以下信息:分子量、分子式、官能团、官能团酸碱性分子量、分子式、官能团、官能团酸碱性. . 样品的来源样品的来源, ,其它定性工具其它定性工具( (红外光谱和紫外光谱等红外光谱和紫外光谱等) )的结构信息的结构信息组分在有机溶剂、水、酸、碱中的溶解度组分在有机溶剂、水、酸、碱中的溶解度, ,对溶剂和酸对溶剂和酸碱的稳定性碱的稳定性. .可分别用水、氯仿、庚烷试验了解组分的可分别用水、氯仿、庚烷试验了解组分的极性极性; ;无论是油溶性还时水溶性样品都可以用用排阻色无论是油溶性还时水溶性样品都可

4、以用用排阻色谱初步试验确定样品的分子量分布及组成的复杂性谱初步试验确定样品的分子量分布及组成的复杂性, ,用用薄层色谱试验估计样品中各个组分大致的分离状况以及薄层色谱试验估计样品中各个组分大致的分离状况以及容量因子范围容量因子范围. 酸碱组分酸碱组分Ka ;样品中大致的杂质样品中大致的杂质;充分利用薄层色谱试验数据充分利用薄层色谱试验数据, 为流动相和固定相选择为流动相和固定相选择提供了必要的信息提供了必要的信息.一般一般,分离方法的选择首先是按分子量大小以及油溶性分离方法的选择首先是按分子量大小以及油溶性或水溶性来选择的或水溶性来选择的.按表按表6-21 和表和表6-22 进行进行.首先被分

5、离样品应能很好地溶解在流动相中，首先被分离样品应能很好地溶解在流动相中，然后根据然后根据样品的性质：极性、解离性、以及其他化学性质选择样品的性质：极性、解离性、以及其他化学性质选择色谱体系及操作条件色谱体系及操作条件-获得合适的分配比和分离度。获得合适的分配比和分离度。6.4 流动相流动相 容量因子容量因子(分配比分配比) k、相对保留值相对保留值r和分离度和分离度RS有有关关.r2,1和和 k是流动相和固定相热力学性质的函数是流动相和固定相热力学性质的函数. 流动相的粘度增加流动相的粘度增加组分分子的扩散系数减小、组分分子的扩散系数减小、传质速度减小传质速度减小,使理论塔板高增加使理论塔板高

6、增加 (H 与与1/2 成正比成正比)。 在液相色谱中在液相色谱中,分离方法确定后分离方法确定后,流动相的选择，流动相的选择，是获得成功分离的关键是获得成功分离的关键. 用作流动相的溶剂用作流动相的溶剂, 要从以下方面考虑使分离达到最佳要从以下方面考虑使分离达到最佳化化: 首先要考虑溶剂的物理性能首先要考虑溶剂的物理性能( 粘度、沸点、紫外吸收粘度、沸点、紫外吸收特征等特征等 )和纯度符合要求和纯度符合要求. 有适当的强度有适当的强度,使样品组分的使样品组分的k有适当的大小有适当的大小, 组分数组分数较少是较少是 2k5; 样品中的组分数较多时样品中的组分数较多时,要求要求0.5k20，最多可

7、选择为最多可选择为0.4k30 ( 这时，最后一个组分的色谱这时，最后一个组分的色谱峰宽已经增宽到非滞留组分保留值的峰宽已经增宽到非滞留组分保留值的30倍倍 ). 考虑溶剂的选择性考虑溶剂的选择性,增大组分的相对保留值增大组分的相对保留值 r2,1. 6.4.1. 对溶剂的要求对溶剂的要求1 1）保证色谱过程的稳定性）保证色谱过程的稳定性 避免流动相组成的改变和固定相性质的变化避免流动相组成的改变和固定相性质的变化2 2）溶剂对样品各个组分的溶解能力和粘度）溶剂对样品各个组分的溶解能力和粘度3 3）溶剂与检测器的匹配）溶剂与检测器的匹配4 4）化学稳定性好）化学稳定性好5 5）溶剂纯度和脱气）

8、溶剂纯度和脱气 要避免脱气时混合溶剂流动相的组成发生变化要避免脱气时混合溶剂流动相的组成发生变化 各溶剂分别脱气然后混合的方法不适于极性强的溶各溶剂分别脱气然后混合的方法不适于极性强的溶剂剂. . 如甲醇如甲醇/ / 水水, , 混合时氢键的形成有显著热效应。混合时氢键的形成有显著热效应。脱气方法脱气方法: : 真空去气、惰性气体驱氧真空去气、惰性气体驱氧( (氦气氦气, ,氢气氢气. .氩气氩气. .氮气氮气) )、加热回流、重新蒸馏、超声波去气加热回流、重新蒸馏、超声波去气等等 脱气的方法脱气的方法超声波脱气时，有可能产生微气泡溶质超声波脱气时，有可能产生微气泡溶质,载气泡载气泡上的吸附服

9、从吉布斯吸附公式：上的吸附服从吉布斯吸附公式：6 6）经济性和安全性）经济性和安全性CRTC 极性固定相体系, 使用二元混合溶剂(B/A)流动相, 若B为极性较强的溶剂, 则B与容量因子的关系为 log klog kBn log XB XB为B在混合溶剂(B/A)中的摩尔分数; n由组分决定其值为1 到 2 之间. 负吸附正吸附CC;6.4.2. 溶剂分离的最佳化要求溶剂分离的最佳化要求1）分子间的作用力与溶剂的极性参数）分子间的作用力与溶剂的极性参数 固定相与组分之间的相互作用主要是四种力：固定相与组分之间的相互作用主要是四种力： 偶极取向力偶极取向力(定向力定向力、诱导力诱导力)、色散力色

10、散力、氢键力氢键力给质子能力和受质子的能力给质子能力和受质子的能力. 溶剂的极性参数溶剂的极性参数 流动相溶解组分的能力越大流动相溶解组分的能力越大,分配比分配比 k 越小越小.液固色谱溶液固色谱溶剂的这种溶解样品能力用溶剂强度参数剂的这种溶解样品能力用溶剂强度参数描写描写.2）. 键合相色谱中溶剂强度和流动相溶剂选择键合相色谱中溶剂强度和流动相溶剂选择溶剂极性参数溶剂极性参数 P 和溶剂强度和溶剂强度 溶剂强度是指流动相将组分从色谱上洗脱下来溶剂强度是指流动相将组分从色谱上洗脱下来的能力（即溶解样品组分的能力）的能力（即溶解样品组分的能力）. 对给定的样品组分对给定的样品组分, 流动相溶剂的

11、溶剂强度越流动相溶剂的溶剂强度越大大, 组分的组分的 k 越小越小, 保留值越小保留值越小. 溶剂强度与溶剂的极性直接相关溶剂强度与溶剂的极性直接相关, 同一溶剂在同一溶剂在不同的色谱体系中不同的色谱体系中, 溶剂强度也不同溶剂强度也不同。 d表示色散力对溶解度的贡献表示色散力对溶解度的贡献(称为色散溶解度参数称为色散溶解度参数)、 o代表偶极取向力对溶解度的贡献代表偶极取向力对溶解度的贡献(称为偶极取向溶解称为偶极取向溶解度参数度参数)、 h代表溶剂分子作为质子给体对溶解度的贡献代表溶剂分子作为质子给体对溶解度的贡献 (称为给称为给质子溶解度参数质子溶解度参数)、 a代表溶剂分子作为质子受体

12、对溶解度的贡献代表溶剂分子作为质子受体对溶解度的贡献 (称为受称为受质子溶解度参数质子溶解度参数), doha 溶解度参数溶解度参数主要作为分配色谱和键合相色谱洗脱序列主要作为分配色谱和键合相色谱洗脱序列的相对强度指标的相对强度指标. 根据根据值的大小比较流动相的强度值的大小比较流动相的强度,控制控制 k 值值.色散色散 偶极偶极 给质子给质子 受质子受质子正相色谱流动相强度随其极性增加而增强正相色谱流动相强度随其极性增加而增强, ,即即增大增大, ,（流动相的极性增加组分溶解在流动相中的量（流动相的极性增加组分溶解在流动相中的量增加，即组分分配在流动相中的量增加，所以：）增加，即组分分配在流

13、动相中的量增加，所以：）溶质组分的溶质组分的 k 减小减小; ;反相色谱流动相强度随其极性增加而减弱反相色谱流动相强度随其极性增加而减弱, ,减减小小, , （流动相的极性增加组分溶解在流动相中的量（流动相的极性增加组分溶解在流动相中的量减减少少，即组分分配在流动相中的量，即组分分配在流动相中的量减少减少，所以：），所以：）溶质组分的溶质组分的 k 增大增大. .Snyder 根据 Rohrschneider 的溶解度数据导出溶剂特性溶剂特性参数参数 P (又称为 溶剂极性指数溶剂极性指数-):P log(K”g)乙醇乙醇log(K” g)二氧六环二氧六环log(K“g)硝基甲烷硝基甲烷log

14、(K“g ) 与与溶剂的气化自由能成正比溶剂的气化自由能成正比,（由化学等温式由化学等温式 ）由由乙醇乙醇、二氧六环二氧六环和和硝基甲烷硝基甲烷分别作溶质分别作溶质（色谱分析色谱分析目标目标组分组分）时的溶解度数据计算得到时的溶解度数据计算得到. 表达了溶剂的强表达了溶剂的强度度或者说或者说溶剂的极性溶剂的极性(溶解溶解强极性组分强极性组分的的能力能力), 又反映又反映了了溶剂的选择性溶剂的选择性(对极性相似的组分对极性相似的组分溶解的选择性溶解的选择性). )32()(ln00STHGKRTo Snyder规定, 溶剂选择性参数计算如下: XClog(Kg)乙醇乙醇/P Xdlog(Kg)二

15、氧六环二氧六环/P Xnlog(Kg)硝基甲烷硝基甲烷/PXC 反映溶剂分子作为反映溶剂分子作为质子质子受体受体对样品对样品乙醇（给质子能力乙醇（给质子能力强）强）作用的能力作用的能力,与与a 相当相当; Xd 反映溶剂分子作为反映溶剂分子作为质子给体质子给体对样品对样品二氧六环二氧六环(受质子受质子能力强能力强)作用的能力作用的能力,与与h 相当相当; Xd 溶剂分子作为溶剂分子作为偶极作用偶极作用的能力的能力, 与与o 相当相当. P 来自溶解度数据来自溶解度数据, , 作为分配色谱溶剂强度的作为分配色谱溶剂强度的度量，也作为流动相极性的度量度量，也作为流动相极性的度量. . 正相色谱正相

16、色谱（流动相极性流动相极性 固定固定相相）, ,流动相的流动相的P 小小, ,样品组分溶解在流动相中样品组分溶解在流动相中多，有较小的多，有较小的k 值值. . 溶剂特性参数溶剂特性参数P用用来描写流动相的溶剂强度来描写流动相的溶剂强度, , 具有加和性具有加和性. . 混合溶剂流动相的溶剂特性参数等于组成流动混合溶剂流动相的溶剂特性参数等于组成流动相各个溶剂的溶剂特性参数的加权平均值相各个溶剂的溶剂特性参数的加权平均值: : Pi Pi i 和和P P i 分别表示组成流动相的分别表示组成流动相的 i 溶剂在流动溶剂在流动相中的体积百分数和其溶剂特性参数相中的体积百分数和其溶剂特性参数. P

17、i Pi 控制色谱分离改善分离的选择性控制色谱分离改善分离的选择性(即改变相对保留值即改变相对保留值r ),通常用改变混合溶剂中的成分来实现通常用改变混合溶剂中的成分来实现. 若初始用的若初始用的混合溶剂流动相有合适的强度混合溶剂流动相有合适的强度, 即即k 值在最佳的范围值在最佳的范围之内之内( 1k10，组分数目很多可考虑，组分数目很多可考虑 0.5k20、或、或0.4k30这时的峰宽已是非滞留组分峰宽的这时的峰宽已是非滞留组分峰宽的30倍倍), 但各组分分离不理想但各组分分离不理想, 即各组分之间的即各组分之间的r不均衡不均衡, 就要就要改变混合溶剂流动相的组成。改变混合溶剂流动相的组成

18、。组成的新混合溶剂流动组成的新混合溶剂流动相的溶剂强度应和最初的相的溶剂强度应和最初的流动相流动相相同相同. 原则上原则上, ,既可以更换混合溶剂中极性弱的成分既可以更换混合溶剂中极性弱的成分A,A,也可以更换混合溶剂中极性强的成分也可以更换混合溶剂中极性强的成分B B来改变选来改变选择性择性. .正相色谱体系正相色谱体系, ,极性强的成分极性强的成分B B与样品组分之间与样品组分之间的的相互作用比极性弱的成分的的相互作用比极性弱的成分A A 要强得多要强得多, , 占占流动相与样品组分相互作用贡献的绝大部分流动相与样品组分相互作用贡献的绝大部分, , 是影响分离选择性的决定因素是影响分离选择

19、性的决定因素. . 因此因此, , 为了改为了改善分离度善分离度, , 通常应该采取更换混合溶剂中极性通常应该采取更换混合溶剂中极性强的成分强的成分B B来达到来达到. . 假定假定, 将非极性溶剂将非极性溶剂A( PA1 )与极性溶剂与极性溶剂B 混合混合, 得到得到混合溶剂混合溶剂B/A, 其其PB/A对给定的分离任务有合适的溶剂对给定的分离任务有合适的溶剂强度强度(有合适的有合适的k 值值),但分离选择性不能满足要求但分离选择性不能满足要求(分离分离度小度小).为改善分离选择性为改善分离选择性,试验用溶剂试验用溶剂C 代替溶剂代替溶剂B, 即即用混合溶剂用混合溶剂C/A代替代替B/A.

20、则应使合溶剂则应使合溶剂C/A的溶剂强的溶剂强度与度与B/A相等相等( 即具有相同的即具有相同的P 值值 ). 即即 A PAB PB CPCAPA 若PA 很小, 可以简化认为B PBCPC, CB (PC / PB)1-氯甲烷氯甲烷 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 四氢呋喃四氢呋喃 氯仿氯仿 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醇乙醇 乙腈乙腈极性增大极性增大 反相色谱反相色谱 反相色谱流动相的极性要比固定相的极性大反相色谱流动相的极性要比固定相的极性大. . 反相色谱用水作为流动相反相色谱用水作为流动相. . 为了改善分离为了改善分离, , 在水中加在水中加入一定量的可以与水混溶的有机溶剂入一定量的可以

21、与水混溶的有机溶剂, , 称为称为“有机改有机改善剂善剂”, ,它们在反相色谱中的溶剂强度比水大它们在反相色谱中的溶剂强度比水大. .其极性其极性顺序顺序( (作为流动相的溶剂强度的顺序则与此相反作为流动相的溶剂强度的顺序则与此相反 ) )为为: : 甲醇甲醇 乙腈乙腈 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃.一般，样品组分在功能团、氢键上有差别时，采用甲醇/水流动相，组分富含双键、或双键位置、极性有差别时，采用乙腈/水流动相，分离含酯基或醚键的组分样品在上述流动相的基础上增加四氢呋喃。 W PW BPBW PW C PC (1B) PW BPB (1C ) PW C PC )1016() (CW

22、BWBCPPPP若用S表示反相色谱中的溶剂强度参数, 并假定水的溶剂强度参数为零, 则其它溶剂的相对溶剂强度参数就可以确定.与正相色谱相似 CB (SC / SB)C, B, SB 和SC分别为溶剂成分B和C在混合溶剂中的体积百分数体积百分数,及它们的溶剂强度参数溶剂强度参数 纯溶剂的极性和保留值的关系纯溶剂的极性和保留值的关系 实验表明实验表明, ,当流动相的当流动相的P 改变改变2个单位时个单位时, ,k 值值大约变化大约变化10 倍倍. .这一关系可以用以下方程式描这一关系可以用以下方程式描写写: : 正相色谱正相色谱)1036(1022112PPkk反相色谱反相色谱)1046(1022

23、112PPkk反相色谱法中的缓冲剂反相色谱法中的缓冲剂 控制在流动相中组分次级化学平衡(副反应)是改善分离选择性的另一途径. 副反应可能影响到样品组分分子原来在溶液中的离解状态、络合平衡、缔合或溶剂化的结构等, 对色谱分离过程的热力学和动力学产生影响. 因此, 可控制流动相的组成来控制样品组分存在的浓度和形态, 最终达到控制样品组分在固定相和流动相的分配平衡, 并抑制杂乱的竞争平衡和副反应. 最简单的办法是通过流动相pH值控制样品组分的离解度, 影响样品组分在流动相中的溶解度, 改变 k 值. 对反相色谱流动相缓冲溶液的要求是对反相色谱流动相缓冲溶液的要求是: :要有足够的纯度要有足够的纯度,

24、 ,在流动相中有足够的溶解度在流动相中有足够的溶解度, ,对流动相所要求的对流动相所要求的 pH 有足够的缓冲容量有足够的缓冲容量, , 要与所用的检测器相匹配要与所用的检测器相匹配, , 不影响色谱制备组分的分离回收不影响色谱制备组分的分离回收, , 对是否具有与样品组分形成离子对、与硅胶载体上的对是否具有与样品组分形成离子对、与硅胶载体上的硅烷醇发生相互作用等特殊性能硅烷醇发生相互作用等特殊性能, , 与固定相不应有相互作用和腐蚀性与固定相不应有相互作用和腐蚀性. . 表表6.286.28列出了在反相色谱中常用的几种缓冲剂的性能列出了在反相色谱中常用的几种缓冲剂的性能. 3. 液液-固色谱

25、的溶解强度固色谱的溶解强度 溶剂强度与溶剂强度参数溶剂强度与溶剂强度参数液-固色谱流动相的洗脱能力与其介电常数成正比.液-固色谱的溶剂强度用表示.并且有 )1086(10log21122112aaAEaaaaaaKKAEKK)(211210sAkk正相色谱正相色谱 AS = (1/2) 反相色谱反相色谱 AS = (1/2) 溶剂在硅胶上洗脱能力序列与在氧化铝上洗脱能力序列基本相同, 硅胶氧化铝能与样品组分发生氢键作用的溶剂能与样品组分发生氢键作用的溶剂, , 有较好的有较好的分离选择性分离选择性. .流动相中的水或其它极性改善剂流动相中的水或其它极性改善剂 常用的极性改善剂有甲醇、乙腈、异丙

26、醚等常用的极性改善剂有甲醇、乙腈、异丙醚等. . 实验证明实验证明, , 用乙腈代替水作极性改善剂时用乙腈代替水作极性改善剂时, ,对样对样品容量、品容量、pH值、值、k 值和值和r 值的影响比水大得多值的影响比水大得多. . 表表6.22 6.22 4. 溶剂分类和流动相选择溶剂分类和流动相选择表 6.32 溶剂的选择性分组组 别溶 剂ab脂肪族醚、三级烷胺、四甲基胍、六甲基磷酰胺脂肪醇吡叮衍生物、四氢呋喃、酰胺(除甲酰胺外)、乙二醇醚、亚砜乙二醇、苯甲醇、甲酰胺、乙胺三氯甲烷、二氯乙烷磷酰三甲苯酯、脂肪族酮和酯、聚醚、二氧六环腈、砜、磺酸丙烯酯硝基化合物、芳香醚、芳烃、卤代芳烃氟烷醇、间苯

27、甲酚、氯仿、水吡啶0.50.50.50.40.40.40.30.30.30.20.20.60.6质子给体质子给体质子受体质子受体偶极偶极xdxexnXClog(Kg)乙醇乙醇/P Xdlog(Kg)二氧六环二氧六环/P Xnlog(Kg)硝基甲烷硝基甲烷/P质子给体质子给体质子受体质子受体bCaBAC偶极体偶极体反向色谱反向色谱:A. 甲醇甲醇, B. 乙腈乙腈, C. THF正相色谱正相色谱: a. 乙醚乙醚 b. 氯仿氯仿 c. CH2Cl2xdxexn41235678109ABC0.67/0.16/0.160 / 0.5 / 0.50.5/ 0.5 /0 0.5/ 0 /0 .5 0.

28、16/0.67/0.160 .16 /0.16/0.676-33 六种甾族激素类药物名称及在样品中的含量、色谱分离峰号名称含量(mg/ml)色谱分离峰号去氧皮质甾酮11-去氧皮质酮皮质甾酮皮质酮皮质醇1皮质酮261.90.71.51.31234564123657MTBE 甲醇 94 MTBE CH Cl甲醇 47 49 4MTBE CHCl甲醇 47 49 4MTBE CHClCH Cl甲醇 31 33 33 3CHClCH Cl甲醇 49 49 2CHCl甲醇 98 2CH Cl甲醇 98 2甲基特丁基醚(-H受体)氯仿(-H给体)二氯甲烷(-强偶极)甲醇(溶剂强度调节剂)己烷(溶剂强度调节

29、剂-k 太大不宜用) 0 2 4 6 81234560 2 4 6 8212,34560 2 4 6 8312,3456 0 2 4 6 824145630 2 4 6 851345620 2 4 6 861245630 2 4 6 871245630 2 4 6 881245636. 液相色谱流动相选择的一般原则液相色谱流动相选择的一般原则4流动相的选择要根据色谱分离体系（正相操作流动相的选择要根据色谱分离体系（正相操作或反相操作）决定或反相操作）决定.4根据根据分离样品的类型（良好溶解度）、分离样品的类型（良好溶解度）、固定相固定相,确定流动相溶剂的类型、配比（适当的确定流动相溶剂的类型、

30、配比（适当的k）。）。4反相色谱法流动相极性越强组分保留时间越大反相色谱法流动相极性越强组分保留时间越大。4正相色谱相反正相色谱相反。4通过选择不同的流动相极性调整组分的保留值。通过选择不同的流动相极性调整组分的保留值。固定相与流动相极性差别越大组保留值越大。固定相与流动相极性差别越大组保留值越大。(调整调整 k 的大小的大小)图图634。4保持溶剂强度保持溶剂强度P ,调整溶剂组成获得适当的调整溶剂组成获得适当的rABAAAAABBBBB样品极性增加流动相极性增加流动相极性增加反相色谱反相色谱 操作操作正相色谱操作保留保留体积增加体积增加使用弱极性固定相 强极性流动相使用强极性固定相 弱极性

31、流动相色谱体系的选择色谱体系的选择普通样品的定性定量分析任务普通样品的定性定量分析任务排阻色谱高分子量样品水溶性 反相排阻油溶性 正相排阻特异性生物物质 亲和色谱水溶性样品反相色谱油溶性样品正相色谱保证样品在流动相中有良好溶解度不离解分子型键合色谱离子型离子交换色谱离子对色谱可离解或可形成离子液相色谱中等分子量非挥发性样品气相色谱低分子量气体(在液体中溶解度小、k太小)低分子量气固色谱气固色谱气液色谱气液色谱300以下挥发性样品色谱体系的选择色谱体系的选择对样品进行快速、高分辨的分析任务对样品进行快速、高分辨的分析任务定量分析为主定量分析为主优先采用液相色谱优先采用液相色谱定性分析为主定性分析

32、为主优先采用毛细管电泳离子型化合物区带电泳DNA/核苷酸等大蛋白质凝胶色谱与凝胶电泳凝胶色谱与凝胶电泳含强疏水基团 电色谱电色谱非离子、倾向疏水化合物离子胶束电动色谱胶束电动色谱低浓度生物质 浓缩等速电泳浓缩等速电泳两性生物质等电聚焦电泳等电聚焦电泳手性异构体拆分 手性毛细管电泳手性毛细管电泳样品（溶解度、挥发性）样品（溶解度、挥发性） 气相色谱 液相色谱(正相或反相色谱) 选择固定相及流动相 气相色谱操作条件(选择固定相和操作温度获得合适选择固定相和操作温度获得合适k) 液相色谱流动相的选择 (选择合适的溶剂强度选择合适的溶剂强度)获得合适的获得合适的k, 调整溶剂中各个组分的比例 (获得符

33、合要求的分离度获得符合要求的分离度 RS)色谱体系的选择色谱体系的选择样品应能够很好溶解在流动相中固定相与样品分子有足够的相互作用力固定相与样品分子有足够的相互作用力色谱体系的优先选择1。挥发性和热稳定性化合物选用气相色谱法2。非挥发性和非热稳定性化合物的用液相色谱分离，须具有适当的容量因子k 用反相色谱操作分离时注意: 含有亲水基团越多(越强) k越小，一般含有相同亲水基团的芳烃比链烃(极性较弱)有更大的k。 对于有酸性、碱性、胺基化合物的分离，为了增加k,应分别在流动相中相应加入酸性、碱性缓冲溶液(抑制样品分子离解)、有机胺类物质（抑制样品中的氨基与固定相上硅羟基相互作用，避免拖尾、保留值

34、不能重复、影响定量分析）3。可离解物质优先用离子对色谱，然后才选择离子交换色谱法4。聚合物和生物大分子用排阻色谱分离5。高分辨高速定性分析，首先采用液相色谱然后才考虑毛细管电泳。离子分离可考虑区带电泳，中性有机物或疏水离子可先考虑用胶束电泳、不然可用电色谱分离，两性分子或离子用等电聚焦或等速电泳分离，DNA/寡聚核苷酸碱基链长不同的样品用凝胶电泳。色谱法难分离问题色谱法难分离问题1。主链超过18碳中部含有取代基的链状化合物位置异构体难以获得分离,( 越靠近端头取代基位置异构体性质差别越大 )2。由于柱的峰容量不足或塔板数不足不能分离的极大组分数的样品(气相毛细管柱色谱或液相色谱)。3。大于85

35、个碳的烷烃或相似保留的同系物分离需要大于1万塔板的柱子4。大于35个碳的烷烃与烯烃混合物的液相色谱分离5。链状化合物的位置异构体的液相色谱分离、芳烃类烷基取代的间对异构体的分离液相色谱液相色谱分离主要依赖于不同组分与固定相之间的色散力、偶极力和氢键力的不同。非极性异构体的范德瓦体积差别极小，这几种力都极小,差别更小。在正相色谱操作时的硅胶柱，由于其表面的硅羟基与样品分子相互作用时仍维持较强的刚性，不同异构体在基团距离或空间位置上有差别，引起在刚性硅胶表面上与硅羟基的相互作用的差别导致保留值不同。但在反相色谱操作时的硅胶柱其表面的硅羟基具有相当的柔性，因此区别异构体的作用几乎消失。9. 梯度洗脱

36、技术梯度洗脱技术tRtB%B APB A PtRtB%tRtB%B AP10. 溶剂的纯化溶剂的纯化所有溶剂都和大气平衡不可避免含有微量水所有溶剂都和大气平衡不可避免含有微量水, , 也含有尘埃也含有尘埃. . 脂肪烃中常含有少量烯烃或芳烃等不饱和组分脂肪烃中常含有少量烯烃或芳烃等不饱和组分: :醚类中可能存在的过氧化物醚类中可能存在的过氧化物, ,加入的抗氧剂作为加入的抗氧剂作为稳定剂稳定剂( (如四氢呋喃中加有丁基甲苯酚如四氢呋喃中加有丁基甲苯酚,BHT);,BHT);卤代烃中常含有痕量卤代烃中常含有痕量HClHCl和和HBrHBr等等, ,而且它们与醚而且它们与醚类反应会生成对不锈钢腐蚀的物质类反应会生成对不锈钢腐蚀的物质; ;含水的流动相还可能含有细菌含水的流动相还可能含有细菌.紫外吸收物质的去除紫外吸收物质的去除: 蒸馏可以除去大部分有紫外吸收的杂质. 如水中的杂质、二氯丙烷中的紫外吸收