第五章 愈伤组织培养

1、第五章 愈伤组织的培养n第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化n第二节第二节 愈伤组织中的形态发生愈伤组织中的形态发生n第三节第三节 人工种子人工种子第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化n1 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导n2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素影响愈伤组织诱导形成的主要因素n愈伤组织愈伤组织(callus)：离体组织离体组织或器官进行离体培养时，进或器官进行离体培养时，进行细胞分裂，形成一种高度行细胞分裂，形成一种高度液泡化的无定形的薄壁细胞。液泡化的无定形的薄壁细胞。From embryo cultureFrom root1 愈伤组织的诱导愈伤组

2、织的诱导 2 愈伤组织的形成愈伤组织的形成n从外植体脱分化形成从外植体脱分化形成典型的典型的愈伤组织大致愈伤组织大致可分为三个时期：可分为三个时期：愈伤组织形成愈伤组织形成起始期起始期分裂期分裂期形成期形成期2. 1 起始期：起始期：n细胞准备进行分裂的时期。细胞准备进行分裂的时期。n外植体的细胞处在外植体的细胞处在静止状态静止状态。n一些一些刺激因素刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧如机械损伤、改变光照强度、增加氧等等)和激素的诱导和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成动加强，蛋白质和核酸的合成, 诱导细胞开始分裂诱导细胞开

3、始分裂。起始期细胞内发生的变化起始期细胞内发生的变化n激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成增加动加强，蛋白质和核酸的合成增加, 诱导细胞诱导细胞开始分裂。开始分裂。n每个细胞的蛋白质总增加量可达每个细胞的蛋白质总增加量可达200 %n酶活性增强，气体交换增加，如氧气的吸收增酶活性增强，气体交换增加，如氧气的吸收增加加n细胞的大小细胞的大小没有多大改变没有多大改变2. 2 分裂期分裂期:分裂期：分裂期：外植体细胞经过诱导以后外植体细胞经过诱导以后脱分化脱分化，不断，不断分分裂增生裂增生子细胞的过程。子细胞的过程。脱分化：脱分化

4、：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能分裂期外植体的特征分裂期外植体的特征:细胞分裂快，结构疏松，细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅其不分化的状态，颜色浅而透明。而透明。n外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加，使得外层细胞数目增加，n细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。逐步回到逐步回到分生组织状态。分生组织状态。n 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量

5、大大增加，新细胞壁合成极快。白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。n细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。维持其不分化的状态，颜色浅而透明。 细胞的主要表现细胞的主要表现:2. 3 形成期：形成期：n指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。同形态和功能的细胞。细胞分裂部位和方向发生改变：细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生内部细胞发生分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的分

6、裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的鸟巢状结构。鸟巢状结构。细胞的体积相对稳定，不再减少。细胞的体积相对稳定，不再减少。出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。老化的多转化为黄色或褐色。 细胞特点：细胞特点： RedWhite callusGreen callusYellow callus根据愈伤色泽划分为：根据愈伤色泽划分为：愈伤组织的分类愈伤组织的分类 易碎的愈伤易碎的愈伤 坚

7、硬的愈伤坚硬的愈伤 生根的愈伤生根的愈伤 渗出粘性多糖的愈伤渗出粘性多糖的愈伤 根据愈伤质地划分为：根据愈伤质地划分为：文心兰的根（文心兰的根（a）茎（）茎（b）叶（）叶（c）诱导的愈伤组织）诱导的愈伤组织根据愈伤发生部位：根据愈伤发生部位：胚性愈伤组织胚性愈伤组织表面呈颗粒状、组织结构紧凑、表面呈颗粒状、组织结构紧凑、再生力强。再生力强。 非胚性愈伤组织非胚性愈伤组织表面粗糙、组织结构疏松。表面粗糙、组织结构疏松。根据愈伤难易程度：根据愈伤难易程度：胚性愈伤组织容易形成胚状体胚性愈伤组织容易形成胚状体非胚性愈伤组织诱导率可达非胚性愈伤组织诱导率可达100，胚性愈伤组织诱导率相对较低。，胚性愈

8、伤组织诱导率相对较低。愈伤组织生长周期愈伤组织生长周期n愈伤组织生长周期为愈伤组织生长周期为24周周。n在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。n转移到新鲜培养基：转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化n1 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱

9、导n2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素影响愈伤组织诱导形成的主要因素（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。不同植物种类、同一植物不同器官来源及其生理状况、不同植物种类、同一植物不同器官来源及其生理状况、年龄的外植体的脱分化（形成愈伤组织）能力有很大年龄的外植体的脱分化（形成愈伤组织）能力有很大差别。差别。n烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；的脱分化比较难；n花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；n幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟

10、的老组织脱分化比幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。较难。2 影响愈伤组织诱导形成的主要因素影响愈伤组织诱导形成的主要因素（2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响。）培养基种类对愈伤组织诱导的影响。 诱导愈伤组织常用的培养基为诱导愈伤组织常用的培养基为MS和和B5。（3）外源激素对愈伤组织诱导的影响）外源激素对愈伤组织诱导的影响-重要因素。重要因素。（4）培养条件对愈伤组织诱导的影响）培养条件对愈伤组织诱导的影响: 湿度条件、湿度条件、温度条件、光照条件。温度条件、光照条件。 2,4-D和和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响处理（处理（2,4-

11、D:BA）愈伤组织形成情况愈伤组织形成情况0: 0仅有，不生长仅有，不生长0: 0.1有限的生长，显绿色有限的生长，显绿色0：0.2生长不良生长不良0.05: 0大块、绿色，平均直径为大块、绿色，平均直径为10mm0.05: 1生长不良，稍带褐色生长不良，稍带褐色0.05: 2生长不良，稍带褐色生长不良，稍带褐色0.1: 0大块，绿色至浅褐色大块，绿色至浅褐色0.1: 0.1大块，绿色至浅褐色大块，绿色至浅褐色0.1: 0.2稍小于稍小于0.1:0.1比例，变褐比例，变褐 各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应（各种生长素浓度为（各种生长素浓度为1

12、0mol/L）生长素生长素愈伤组织形成愈伤组织形成种子种子下胚轴下胚轴果皮果皮IBA无愈伤组织形成无愈伤组织形成愈伤组织增殖强愈伤组织增殖强IBA浓度为浓度为1mol/L时愈时愈伤组织生长良好伤组织生长良好NAA无愈伤组织形成无愈伤组织形成所有外植体均产生所有外植体均产生愈伤组织愈伤组织愈伤组织增殖强愈伤组织增殖强2,4-D所有外植体均产所有外植体均产生愈伤组织生愈伤组织2,4-D浓度为浓度为1mol/L时时愈伤组织生长良好愈伤组织生长良好愈伤组织增殖强愈伤组织增殖强NOA萘氧乙酸萘氧乙酸无愈伤组织形成无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖中等NOP萘氧丙酸

13、萘氧丙酸无愈伤组织形成无愈伤组织形成愈伤组织增殖中等愈伤组愈伤组织增殖中等愈伤组织增殖强织增殖强愈伤组织增殖强愈伤组织增殖强第五章 愈伤组织的培养n第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化n第二节第二节 愈伤组织中的形态发生愈伤组织中的形态发生n第三节第三节 人工种子人工种子1 愈伤组织形态愈伤组织形态 发生方式发生方式愈伤组织器官发生愈伤组织器官发生通过通过体细胞胚胎体细胞胚胎/胚胚状体状体途径再生植株途径再生植株第二节第二节 愈伤组织中的形态发生愈伤组织中的形态发生2 愈伤组织器官发生愈伤组织器官发生 n先不定芽，在茎基部长根先不定芽，在茎基部长根n先长根先长根 后长芽后长芽

14、n在不同部位分别形成根和芽在不同部位分别形成根和芽 无机盐混合物类无机盐混合物类 营养条件营养条件 有机物类有机物类 植物激素类植物激素类 天然复合物类天然复合物类 外因外因 渗透压渗透压 酸碱度酸碱度影响因子影响因子 环境条件环境条件 湿度湿度 温度温度 光照光照 内因内因 遗传性遗传性 生理状态生理状态 影响愈伤组织器官发生的因素：影响愈伤组织器官发生的因素： 植物激素的作用植物激素的作用 外植体自身因素外植体自身因素（1）外植体自身因素外植体自身因素（内因）（内因）母体植株的遗传基础母体植株的遗传基础n被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠

15、科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功报道最多；成功报道最多；n无性繁殖植物比有性繁殖植物的容易；无性繁殖植物比有性繁殖植物的容易；n同种植物不同品种（基因型）的培养效果不同同种植物不同品种（基因型）的培养效果不同 外植体的类型外植体的类型 影响培养的难易：影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源一般生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞容易培养。容易培养。 例：百合：例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层鳞茎的鳞片分化能力：外层中层中层内层内层 高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；高：有利于根的形成

16、和愈伤组织的形成； 适中：有利于根芽的分化；适中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成低：有利于芽的形成生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。 （2）植物激素的作用（外因）植物激素的作用（外因）芦荟的植物组织培养过程芦荟的植物组织培养过程1 2 3 4 56 7 8 910 11芽（单芽、丛芽）芽（单芽、丛芽）1 愈伤组织形态愈伤组织形态 发生方式发生方式愈伤组织器官发生愈伤组织器官发生通过通过体细胞胚胎体细胞胚胎/胚胚状体状体途径再生植株途径再生植株第二节第二节 愈伤组织中的形态发生愈伤组织中的形态发生3.

17、1 3.1 胚状体胚状体/ /体细胞胚体细胞胚（embryoidembryoid） ：指植物指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类类似胚似胚一样的细胞群。一样的细胞群。 经过：球形胚心形胚鱼雷形胚成熟胚经过：球形胚心形胚鱼雷形胚成熟胚3 3 体细胞胚发生途径体细胞胚发生途径Development of the Arabidopsis Embryo 石龙芮胚状体发生的过程石龙芮胚状体发生的过程 香蕉心形体细胞胚 玫瑰心形体细胞胚 3.2 体细胞胚的产生方式体细胞胚的产生方

18、式n1）直接在器官上发生）直接在器官上发生n2） 悬浮培养细胞发生途径悬浮培养细胞发生途径n3）愈伤组织发生途径）愈伤组织发生途径 : 幼胚、胚和子叶幼胚、胚和子叶n4）单细胞发生途径：）单细胞发生途径：花药培养中的小孢子发育成花药培养中的小孢子发育成n4）原生质体发生途径）原生质体发生途径胚性愈伤组织胚性愈伤组织1）生长素）生长素2）其他植物生长物质的作用）其他植物生长物质的作用3）氨源形态的影响）氨源形态的影响4）其他培养条件对胚状体发生的影响）其他培养条件对胚状体发生的影响3.3 体细胞胚状体诱导的影响因素3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素1）生长素）生长素n形成体细胞胚的关键形成体细胞

19、胚的关键是是除去或降低培除去或降低培养基中的生长素成分养基中的生长素成分（如（如2,4-D）。）。n愈伤组织在愈伤组织在生长素生长素0.51mg/L的培养的培养基上分化形成分生细胞团（称胚性细基上分化形成分生细胞团（称胚性细胞团）；胞团）；n转移到生长素含量很低或没有生长素转移到生长素含量很低或没有生长素的培养基上，就能发育为胚状体。的培养基上，就能发育为胚状体。n原因：原因：2,4-D等生长素可以诱导内源乙烯（等生长素可以诱导内源乙烯（Eth）产生；内源产生；内源Eth不影响愈伤增殖，但抑制愈伤不影响愈伤增殖，但抑制愈伤组织进一步分化成胚。组织进一步分化成胚。n乙烯也会导致纤维素酶或（和）果

20、胶酶活性的乙烯也会导致纤维素酶或（和）果胶酶活性的增强，从而破坏胚性细胞团，使原胚不能发生增强，从而破坏胚性细胞团，使原胚不能发生组织分化。组织分化。2）其他植物生长物质的作用）其他植物生长物质的作用细胞分裂素有利于胚状体的形成细胞分裂素有利于胚状体的形成n0.1gL-1 玉米素玉米素促进胡萝卜体细胞胚发生。促进胡萝卜体细胞胚发生。nGA3、ABA抑制成胚；抑制成胚；3）氨源形态的影响）氨源形态的影响n还原还原N（NH4+）n氧化氧化N（NO3-） n有机氮有机氮 （氨基酸、水解酪蛋白等）（氨基酸、水解酪蛋白等）n野生胡萝卜叶柄节段的培养中，只有在含一定野生胡萝卜叶柄节段的培养中，只有在含一定

21、数量数量还原态氮还原态氮的培养基时，才能有胚胎发生，的培养基时，才能有胚胎发生，n用用NH4+ 和水解酪蛋白优于和水解酪蛋白优于NO3- 或谷氨酰胺。或谷氨酰胺。4）其他培养条件对胚状体发生的影响）其他培养条件对胚状体发生的影响n液体培养液体培养n适宜适宜pH5-6n光照：不需要光或半天光照时间光照：不需要光或半天光照时间n温度温度25 左右左右光照强度光照强度50-60 E m2 s-1光照强度光照强度5-10 E m2 s-1( (图图 光对大豆不同品种子叶体细胞胚发生的影响光对大豆不同品种子叶体细胞胚发生的影响 ) )3.4 体细胞胚途径再生植物的优点体细胞胚途径再生植物的优点1）数量）

22、数量比不定芽多比不定芽多2）获得速度快）获得速度快3）结构完整）结构完整4）胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；）胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；5）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第五章 愈伤组织的培养n第一节第一节 愈伤组织的诱导和分化愈伤组织的诱导和分化n第二节第二节 愈伤组织中的形态发生愈伤组织中的形态发生n第三节第三节 人工种子人工种子n人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。人工种子是指外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。n n胚状体或芽胚状体或芽：有生命的物质结构。有生命的物质结构。n人工胚乳：人工胚乳：供胚状体维持生命力

23、。供胚状体维持生命力。n人工种皮人工种皮：保护作用。：保护作用。1 定义与结构定义与结构 第三节第三节 人工种子人工种子1）结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直）结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；接播种，易于机械化操作；2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；多、繁殖快、有利于工厂化生产；人工种子的优点人工种子的优点:3) 有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；4) 加入抗生素

24、、农药、菌肥等成分，提高人工种加入抗生素、农药、菌肥等成分，提高人工种子活力和品质；子活力和品质；5) 由无性繁殖体系产生胚，由无性繁殖体系产生胚， 固定杂种优势。固定杂种优势。 2 制作制作人工种子制作过程人工种子制作过程胚状体胚状体人工胚乳人工胚乳其他物质其他物质人工种皮人工种皮包埋包埋技术技术第一步胚状体诱导n1）选取目标植物）选取目标植物n2）诱导愈伤组织）诱导愈伤组织n3）愈伤组织增生）愈伤组织增生n4）胚状体诱导）胚状体诱导胚状体胚状体同步增殖同步增殖：nDNA合成抑制剂合成抑制剂n低温处理低温处理n调节渗透压调节渗透压n分离过筛分离过筛n调节植物激素配比调节植物激素配比第二步人工胚乳制作人工胚乳的成分人工胚乳的成分n 无机盐混合物无机盐混合物 n 碳水化合物：淀粉和糖碳水化合物：淀粉和糖 n 蛋白质蛋白质 n各种附加成分：如固氮细菌、杀虫剂、杀菌各种附加成分：如固氮细菌、杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物激素等剂、除草剂和植物激素等 2）包埋技术）包埋技术 用褐藻酸钠等水溶性凝胶经与用褐藻酸钠等水溶性凝胶经与Ca2+进进行