实验五、细菌的芽孢染色法

1、实验五、细菌的芽孢染色法实验五、细菌的芽孢染色法实验的目的要求实验的目的要求v学习并掌握芽孢染色法学习并掌握芽孢染色法v初步了解芽孢杆菌的形态特征初步了解芽孢杆菌的形态特征细菌芽孢染色的意义细菌芽孢染色的意义v芽孢又称内生孢子，是某些细菌生长到芽孢又称内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。呈圆形或椭圆形。v细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。等特征是鉴定细菌的依据之一。细菌芽孢的基本构造细菌芽孢的

2、基本构造孢外壁孢外壁芽孢衣芽孢衣皮层皮层芽孢壁芽孢壁芽孢质膜芽孢质膜芽孢质芽孢质芽孢核区芽孢核区v形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件因菌种形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件因菌种而异。而异。炭疽芽孢杆菌在有氧炭疽芽孢杆菌在有氧(O(O2 2) )条件下才能形成条件下才能形成芽孢，而破伤风芽孢杆菌则在无氧条件下形成芽芽孢，而破伤风芽孢杆菌则在无氧条件下形成芽孢。孢。v芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力，尤其耐芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力，尤其耐高温。高温。如肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢，在沸水中可如肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢，在沸水中可存活存活6 6小时，在小时，在180180的干热中，的干热中

3、，1010分钟仍可存活。分钟仍可存活。在一定条件下，芽孢保持活力数年至数十年之久。在一定条件下，芽孢保持活力数年至数十年之久。高温灭菌的主要目的就是杀死细菌的芽胞。高温灭菌的主要目的就是杀死细菌的芽胞。v芽孢在适宜条件下萌发成新个体，但芽孢在适宜条件下萌发成新个体，但一个芽孢只一个芽孢只产生一个营养体，所以芽孢不是一种繁殖方式。产生一个营养体，所以芽孢不是一种繁殖方式。v细菌的芽孢细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色( (芽孢呈芽孢呈无色透明状无色透明状) )。v芽孢染色法就是根据芽孢既难

4、以染色而一旦染上芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。后又难以脱色这一特点而设计的。v所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。能更明显地衬托出芽孢，便

5、于观察。细菌芽孢染色原理细菌芽孢染色原理材料材料v菌种菌种: :苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌v 染色剂：染色剂：5%5%孔雀绿水溶液孔雀绿水溶液0.5%0.5%番红水溶液番红水溶液v 仪器或其他用具：仪器或其他用具：EppendorfEppendorf管管EppendorfEppendorf管架管架载玻片载玻片显微镜显微镜电磁炉电磁炉搪瓷烧杯搪瓷烧杯方法方法vSchaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法(P78)(P78)v改良的改良的Schaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法v制片制片v染色染色

6、v脱色脱色v复染复染v镜检镜检Schaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法v制备菌悬液制备菌悬液v染色染色v涂片固定涂片固定v脱色脱色v复染复染v镜检镜检改良的改良的Schaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法制制 片片生理盐水生理盐水 1、滴生理盐水、滴生理盐水 挑取少量菌苔挑取少量菌苔与生理盐水混匀与生理盐水混匀均匀涂布均匀涂布或电吹风吹干或电吹风吹干2、涂片、涂片滴半滴生理滴半滴生理盐水在载玻盐水在载玻片中央片中央 3、干燥、干燥室温自然晾干室温自然晾干染染 色色5%孔雀绿染液孔雀绿染液1、滴孔雀绿染液、滴孔雀绿染液

7、滴加数滴孔滴加数滴孔雀绿染液在雀绿染液在菌膜上菌膜上 2、加热染色、加热染色用木夹夹住载用木夹夹住载玻片一端，在玻片一端，在微火上加热微火上加热至冒蒸汽开始计至冒蒸汽开始计时，维持时，维持5min沸腾：菌体或芽孢囊破裂；沸腾：菌体或芽孢囊破裂；加热不够：芽孢难以着色加热不够：芽孢难以着色。注意补充染液，注意补充染液，以免涂片干涸以免涂片干涸脱色脱色待玻片冷却后待玻片冷却后，水洗脱色，水洗脱色不要直接冲菌膜不要直接冲菌膜复复 染染0.5%番红水溶液番红水溶液1、滴番红水溶液、滴番红水溶液滴加数滴滴加数滴番红染液番红染液在菌膜上，在菌膜上，染色染色2min2、水洗、水洗不要直接冲菌膜不要直接冲菌膜镜镜 检检或吸水纸吸干或吸水纸吸干1、干燥、干燥或电吹风吹干或电吹风吹干室温自然晾干室温自然晾干2、镜检、镜检显微镜操作显微镜操作油镜使用油镜使用制备菌悬液制备菌悬液生理盐水生理盐水 1、滴生理盐水、滴生理盐水 挑取挑取2-3环菌苔环菌苔与生理盐水混匀与生理盐水混匀均匀均匀2、制备菌悬液、制备菌悬液在在EP管中滴管中滴2滴生理盐水滴生理盐水染色染色5%孔雀绿染液孔雀绿染液1、滴加孔雀绿染液、滴加孔雀绿染液沸水浴加热沸水浴加热15-20min2、加热染色、加热染色在在EP管中滴管中滴2-3滴孔雀绿染液滴孔雀绿染液涂片固定涂片固定经孔雀绿染经孔雀绿染色细菌