酶组织化学-刘学光

1、酶组织化学酶组织化学刘刘学学光光复旦大学基础医学院病理学系复旦大学基础医学院病理学系酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质 一般催化剂的共性：一般催化剂的共性： 1. 1. 用量少而催化效率高用量少而催化效率高 2. 2. 不改变化学反应的平衡点不改变化学反应的平衡点 3. 3. 可降低反应的活化能可降低反应的活化能 作为生物催化剂的特性：作为生物催化剂的特性： 1. 1. 催化效率高：催化效率高： 比其他催化反应高比其他催化反应高10107 7-10-101313倍倍 2. 2. 高度专一性高度专一性 3. 3. 易失活易失活 4. 4. 酶活力受调节控制酶

2、活力受调节控制 5. 5. 酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 酶的酶的分类分类、命名、命名1.1.习惯命名法：习惯命名法：底物，所催化的反应性质，来源，其他特点2.2.国际系统命名法：国际系统命名法：酶的底物 + 催化反应的性质3.3.主要分类：主要分类：催化反应的性质，六个大类（1）氧化还原酶:氧化还原反应（2）移换酶：功能基团的转移反应（3）水解酶：水解反应（4）裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键，或其逆反应（5）异构酶：同分异构体的相互转变（6）合成酶：连接酶 催化一切必须与ATP分解相偶联且由两种物质（双分子）合成一种物质的反应酶组织化学

3、酶组织化学( Enzyme Histochemistry) 通过细胞内固有的酶催化底物的作用，并借助显色反应，通过细胞内固有的酶催化底物的作用，并借助显色反应，在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位。 特点特点 （1）原位检测）原位检测：组织定位组织定位 （2）显示显示酶活性酶活性 发展历史发展历史l Klebs(1868)年&Struve(1872)证明中性多核白细胞过氧化酶存在l1939年前，研究细胞内的氧化反应1939年，Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶（硫化钴反应 、银反应） 随后：磷酰胺酶、 ATP酶、

4、 脂酶、酯酶等 金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法l 电镜酶组织化学：酶更精准的定位 1955年 Scheldon、 Brandes 金属沉淀法 1967年 Seligman 锇黑化法l 免疫组织化学：抗原抗体反应+酶反应 1970年 Sternberger 酶标抗体法 基础知识基础知识（一）细胞内的酶的特性（一）细胞内的酶的特性 * * 水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂 * * 有机溶剂不同程度降低酶的活性有机溶剂不同程度降低酶的活性 * * 易受温度影响，对热耐受性弱易受温度影响，对热耐受性弱 * * 对干燥耐受

5、性强对干燥耐受性强（二）酶的定位（二）酶的定位 在细胞内或超微结构中存在于特定部位在细胞内或超微结构中存在于特定部位 浆膜浆膜 5-核苷酸酶核苷酸酶 细胞膜细胞膜 ATPase 线粒体线粒体 1. 酶促反应酶促反应 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物，即：初反应物物，即：初反应物(primary reaction product, PRP)。2. 显色反应显色反应 其中之一再与辅助物经一步或二步反应，生成其中之一再与辅助物经一步或二步反应，生成有色不溶水有色不溶水的的终反应物终反应物(final reaction product, FRP) 沉积

6、沉积在在原位原位以显示酶的存在和活性大小。以显示酶的存在和活性大小。酶组织化学的基本原理酶组织化学的基本原理Artifact PRP弥散弥散 定位不准确定位不准确 受受3个因素影响：个因素影响： 1. 底物在酶催化下水解的速度底物在酶催化下水解的速度 快快 2. PRP在缓冲液中的弥散系数在缓冲液中的弥散系数 小小 3. PRP与辅助物反应的速度与辅助物反应的速度 快快 辅助物浓度一般辅助物浓度一般1 mg/ml 一般原则一般原则 最大限度保存酶活性、防止弥散、保证反应产物的特异性最大限度保存酶活性、防止弥散、保证反应产物的特异性 1. 标本标本处理及制片不能影响酶活性和分布处理及制片不能影响

7、酶活性和分布 2. 底物对酶有特异性：酶抑制剂底物对酶有特异性：酶抑制剂/激动剂检测特异性激动剂检测特异性 3. 底物和辅助试剂渗透好：迅速底物和辅助试剂渗透好：迅速，同步同步 4. 辅助试剂不能影响酶活性和其它反应剂的渗透辅助试剂不能影响酶活性和其它反应剂的渗透 5. PRP与辅助试剂反应要快与辅助试剂反应要快 FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质必需是水不溶、有色且稳定的物质 6. 所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附主要步骤1.组织处理：不固定（冷冻切片，新鲜）组织处理：不固定（冷冻切片，新鲜） 固固 定（特殊固定剂，低温包埋）定（特殊固定剂，低温

8、包埋）2.孵育孵育3.显色显色4.显微镜下观察显微镜下观察各步骤需要注意的问题各步骤需要注意的问题：1. 组织处理：组织处理：“最大限度保存酶活性最大限度保存酶活性” 最常用：新鲜组织，快速冷冻，冰冻切片最常用：新鲜组织，快速冷冻，冰冻切片 长期保存需密封长期保存需密封，-70 丙酮固定，低温脱水、包埋（丙酮固定，低温脱水、包埋（eg. -谷氨酰转肽酶）谷氨酰转肽酶） 常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶）常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶） 染色前的染色前的预固定预固定 保持组织良好形态保持组织良好形态 丙酮丙酮:氯仿氯仿=1 : 1 4oC，510 分钟分钟 多聚甲醛，甲醛，戊二醛多聚甲醛，甲醛

9、，戊二醛 Note: 含有抑制酶活性含有抑制酶活性/细胞化学成分活性的重金属盐细胞化学成分活性的重金属盐Hg/Cr/Pb等等 不用做固定剂不用做固定剂 固定方法：浸泡固定固定方法：浸泡固定 灌流固定灌流固定 细胞涂片、培养细胞细胞涂片、培养细胞: 干燥、密封、低温干燥、密封、低温2.2.切片制作切片制作: : 一般一般8 81212m m 3.3.缓冲液缓冲液： 用于用于配置固定液，漂洗液，酶反应孵育液配置固定液，漂洗液，酶反应孵育液 配制酶反应配制酶反应孵育液孵育液 （1 1）清洗器皿，过酸冲洗）清洗器皿，过酸冲洗 （2 2）现用现配，保持新鲜）现用现配，保持新鲜 （3) 3) 严格配比，保

10、持平和严格配比，保持平和 （4 4）防止污染）防止污染 过滤为佳过滤为佳 （5 5）优选试剂，注意纯度）优选试剂，注意纯度4. 4. 孵育反应孵育反应 a. a. 温度及时间温度及时间：3737o oC C，15-30min15-30min b. b. 孵育反应：切片孵育；漂浮孵育孵育反应：切片孵育；漂浮孵育 5. 5. 酶显示方法酶显示方法 （1 1）同步显示法）同步显示法 （2 2）二步显示法（孵育后偶联法）二步显示法（孵育后偶联法） （3 3）底物自身显示法）底物自身显示法6. 6. 酶特异性对照实验用酶活性抑制剂用酶活性抑制剂激活剂激活剂采用无底物的孵育液采用无底物的孵育液过固定或加热

11、过固定或加热改变孵育液改变孵育液选择选择PHPH值值细胞内的定位差异细胞内的定位差异对结果分析要考虑的问题经冷冻和原位固定后经冷冻和原位固定后，酶究竟能保存多少，酶究竟能保存多少? ?酶是否在原位酶是否在原位? ?反应酶起了多少作用？反应酶起了多少作用？酶的活性是否代表了细胞生活时的状态酶的活性是否代表了细胞生活时的状态? ?沉淀的产物是否代表酶本身，时间延长是否会有改沉淀的产物是否代表酶本身，时间延长是否会有改变，有没有扩散移位？变，有没有扩散移位？常用酶显示常用酶显示方法方法 （1 1）同步显示法同步显示法：PRP + PRP + 辅助物辅助物 有色有色FRPFRP 某些金属本身或化合物生

12、成颜色某些金属本身或化合物生成颜色（eg.eg.金属离子沉淀反应）金属离子沉淀反应） 硫化钴（黑色）硫化钴（黑色） 硫化铅（棕黑色）硫化铅（棕黑色） （2 2）二步显示法二步显示法（孵育后偶联法）（孵育后偶联法） 酶与底物作用产生的酶与底物作用产生的PRPPRP沉积于原位，随后行显色反应沉积于原位，随后行显色反应 适用于：适用于：PHPH反应差别大；底物反应差别大；底物/ /辅助物易分解辅助物易分解 局局 限：要求限：要求PRPPRP弥散度低弥散度低 （3 3）底物自身显示法底物自身显示法 可溶有色底物可溶有色底物 不溶有色底物不溶有色底物 底物分子重组底物分子重组(1) 金属离子沉积法金属离

13、子沉积法 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomori反应反应（1941年）年） 以以beta-甘油磷酸钠为底物，在酸性甘油磷酸钠为底物，在酸性PH值值(4.4-5.5)下，被下，被酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（ACP）水解，释放出磷酸盐。遇铅离子（水解，释放出磷酸盐。遇铅离子（硝酸硝酸铅铅/醋酸铅）生成磷酸铅醋酸铅）生成磷酸铅(PRP)，再被，再被S2-置换，最终生成硫化置换，最终生成硫化铅棕黑色沉淀铅棕黑色沉淀。 酶促反应酶促反应 R-PO4Na2+H20 R-OH +Pb3(PO4) 2 显色反应显色反应 Pb3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS （棕黑色沉淀）（棕黑色沉淀） 该方法金属离子容易反应

14、，沉着颗粒微细，反应色调美该方法金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调美丽，反差明显丽，反差明显 。 ACPPb 2+ 激活剂激活剂：Mn2+ 抑制剂抑制剂：NaF定定 位位：溶酶体，：溶酶体，ER， 胞胞浆浆该酶活性比较高的器官该酶活性比较高的器官：肝、肾、肠、脾、肾上腺：肝、肾、肠、脾、肾上腺注意事项注意事项:铅离子铅离子 浓度是关键：非特异性吸附浓度是关键：非特异性吸附，NaF处理排除假阳性处理排除假阳性孵育时间不宜过长：弥散，核非特异着色孵育时间不宜过长：弥散，核非特异着色铅法适用于铅法适用于: ACP； 5-核苷酸酶；核苷酸酶； G6P酶酶；膜膜ATPase； 线粒体线粒体ATPa

15、se； TTPase(硫氨酸焦磷酸酶）硫氨酸焦磷酸酶）（2 2）偶氮盐偶联反应）偶氮盐偶联反应 人工合成的酶底物在酶的作用下产生人工合成的酶底物在酶的作用下产生PRP，后者与重氮盐，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其生成不溶性的偶氮色素结合，引起偶联偶氮反应，使其生成不溶性的偶氮色素 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 a-萘基磷酸钠萘基磷酸钠 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 + a -萘酚萘酚 -萘酚萘酚 + Fast Blue 偶氮染料偶氮染料 （蓝色沉淀）（蓝色沉淀） 酯酶、转肽酶、肽酶酯酶、转肽酶、肽酶酶酶+水水重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样（蓝色，紫色，红色，重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样（蓝色，紫色

16、，红色，褐色等）褐色等） 常用重氮盐常用重氮盐: 坚牢兰坚牢兰RR 坚牢兰坚牢兰B 坚牢兰坚牢兰RC 坚牢兰坚牢兰TR 坚坚牢兰牢兰B 六偶氮副品红六偶氮副品红 六偶氮新品红六偶氮新品红常用底物：萘酚常用底物：萘酚AS-B1 萘酚萘酚AS-D 萘酚萘酚AS-MX 萘酚萘酚AS-TR应用：应用：ALPase, ACPase 酯酶，酯酶， 转肽酶，肽酶，转肽酶，肽酶， beta-葡糖葡糖苷酶苷酶方法：同时偶联法方法：同时偶联法 后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用(3) 四唑反应四唑反应 底物底物 氢离子氢离子 与无色四唑盐结合与无色四唑盐结合常用四唑盐种类常用四唑

17、盐种类: 三苯四唑氯化物三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐蓝四唑盐 BT 新四唑盐新四唑盐 NT 硝基兰四唑盐硝基兰四唑盐(nitroblue tetrazolium, NBT) 四硝基兰四唑四硝基兰四唑TNBT 噻唑兰噻唑兰 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)红色红色 / 蓝色沉淀蓝色沉淀 脱氢酶脱氢酶/氧化酶氧化酶被还原被还原单胺氧化酶和几乎所有的脱氢酶单胺氧化酶和几乎所有的脱氢酶都可以用都可以用四唑反四唑反应应显示显示 例例：四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶 以琥珀酸（钠盐

18、）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（NBT）为受氢体，还原为紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标记酶之一，存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮、肝细胞含量最丰富(4) 联苯胺色素法联苯胺色素法过氧化物酶过氧化物酶（联苯胺法）（联苯胺法） NH2NH2酶酶 + H2O2NHNH棕色沉淀棕色沉淀2H联苯胺联苯胺蓝 过氧化物酶过氧化物酶催化各种物质被过氧化氢所氧化见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等髓过氧化物酶见于中性/嗜酸性白细胞及其前体细胞，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂 DAB 3-二氨基联苯胺(5) 靛蓝

19、反应靛蓝反应 底物被酶分解为二个底物被酶分解为二个PRP，其中之一可在一定条件下形，其中之一可在一定条件下形成不溶的靛蓝成不溶的靛蓝 酯酶酯酶 吲哚酚酯吲哚酚酯 吲哚酚吲哚酚 + RCOOH 2 吲哚酚吲哚酚 靛蓝靛蓝 胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶 酶酶 + 水水氧化氧化酶组织化学的应用了解组织、细胞的代谢活动了解组织、细胞的代谢活动细胞类型的判断细胞类型的判断了解细胞定位了解细胞定位用于肿瘤的研究用于肿瘤的研究用于免疫组化和杂交组化的显示手段用于免疫组化和杂交组化的显示手段（1）观察组织细胞代谢）观察组织细胞代谢心肌梗死心肌梗死2小时小时 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶 HE无改变无改变 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 磷酸化酶磷酸化酶Reyes Syndrome又称脑病脂肪肝综合征，是一种急性脑病和肝脏脂又称脑病脂肪肝综合征，是一种急性脑病和肝脏脂肪浸润综合征肪浸润综合征,常常发生于某些急性病毒性传染病以后，常常发生于某些急性病毒性传染病以后，多见于儿童